Инженерная энзимология – разработка биотехнологических процессов, в которых используются каталитическое действие ферментов, выделенных из состава биологических систем или находящихся в клетках, искусственно лишенных способности роста. В основе инженерной энзимологии лежит применение иммобилизованных ферментов или ферментных систем. В живых системах ферменты способны функционировать достаточно длительное время без существенных потерь активности. В промышленности при использовании ферментных препаратов, ферменты, как правило, инактивируются после одноразового использования. С одной стороны, это объясняется тем, что в клетках ферменты находятся в иммобилизованном состоянии и, кроме того, производственным циклом – действие фермента и последующее выделение продукта, в ходе которого, фермент инактивируется и часто является балластом, загрязняющим целевой продукт. Одним из способов решения этой проблемы является иммобилизация фермента или ферментного препарата, т.е. перевод его в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности. Этого можно добиться: закреплением фермента внутри или на поверхности нерастворимого носителя; внутримолекулярной или межмолекулярной сшивкой белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными агентами; присоединением к растворимому полимеру; ограничением подвижности фермента с помощью мембран. В общем виде иммобилизованный фермент представляет систему, состоящую из трёх частей: фермент (Ф); носитель (Н); связующий агент (С).
В 1916 г. Гриффином был получен первый иммобилизованный фермент – инвертаза адсорбированная на активированном угле. В 1939 г. Пфанмюллер и Шлейт получили первый патент на пектолитические ферменты иммобилизованные на древесных опилках, а в 1953 г. Шлейтом был разработан метод ковалентного связывания фермента и носителя.
На I конференции по инженерной энзимологии (США, 1971 г.) было дано определение иммобилизованным ферментам. Это препараты ферментов, связанные на нерастворимых носителях. Более широкое определение – ограничение движения белковых молекул или их фрагментов в пространстве внутри- и межмолекулярными сшивками низкомолекулярными бифункциональными агентами или их присоединением к растворимому полимеру.
К преимуществам иммобилизованных ферментов и ферментных препаратов можно отнести:
-возможность отделения фермента от среды, содержащей продукты катализируемой реакции), для его повторного использования;
-непрерывность и возможность регуляции процесса;
-увеличение стабильности фермента (технологичность), хотя иммобилизация часто снижает активность фермента (до 70% для ковалентных методов иммобилизации);
-целенаправленное изменение свойств ферментов по стабильности, рН, температуре, скорости реакции и специфичности (особенно для макромолекулярного субстрата).
Носители для иммобилизации. Носители подразделяются на следующие группы: органические (полимерные и низкомолекулярные); неорганические.
Органические носители подразделяются на природные и синтетические. К природным носителям относятся полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические классифицируют в соответствии со строением основной цепи углеродного скелета (полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные). К носителям предъявляют следующие требования, обусловленные как методом иммобилизации, так и свойствами ферментов: доступность; гидрофильность; инертность; связь между носителем и ферментом не должна затрагивать активный центр фермента; носитель и фермент должны иметь разноименные заряды; носители должны иметь большую площадь поверхности (уменьшение размера носителя увеличивает количество закрепляемого на его поверхности фермента); содержать реакционно-способные группы.
Наиболее широко используются природные – полисахаридные (нативные и модифицированные) и синтетические носители. Из полисахаридов часто применяют: целлюлозу; декстран; агарозу и их производные (АЭЦ-, ДЭАЭ-целлюлозу, фосфорилцеллюлозу (OPO3H2-), КМЦ (О-СН2-СООН), аминобензилцеллюлозу, сшитые эпихлоргидрином декстраны – сефадексы, карбоксиметилсефадекс, ДЭАЭ-сефадексы, карбоксиметил- и сульфометилсефадексы, фенилсефарозу и т.д.). Используют также агар, альгинаты, гепарин (углеводные цепи представлены сульфатированными остатками D-глюкуроновой кислоты и сульфатированными остатками глюкозамина). Из природных носителей, применяемых в медицине можно отметить также белки (коллаген и фибрин).
Из синтетических носителей широко используют носители на основе промышленных марок ионообменных смол, а именно полимеры на основе стирола и дивинилбензола (Дауэкс, Амберлит), которые характеризуются высокой механической прочностью, стабильностью и нерастворимостью. К недостатку их можно отнести то, что они имеют гидрофобную поверхность. Поэтому их модифицируют (вводят ангидридные группы). Например, сополимеризуют малеиновый ангидрид со стиролом, с дополнительной поперечной сшивкой углеродных цепей гексаметилендиамином. Кроме того, используют носители на основе полиакрилатов. Например, полиакриламидный гель (ПААГ), который дополнительно сшит N,N -метилен- бис -акриламидом: (биогели, энзакрилы и акрилексы). Созданы и смешанные носители на основе акриламида и агарозы (ультрогели), сополимеры акриламида и малеинового альдегида, метакриловой кислоты и т.д.
Органические низкомолекулярные носители:
а) липиды (лецитин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин);
в) синтетические аналоги липидов (ПАВ): бис -2-этилгексиловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты (анионные ПАВ); цетилтриметиламмонийбромид (катионные ПАВ); тритон Х-100 (поли (9-10) оксиэтилена октилфениловый эфир (неионогенные ПАВ); алкилдиметилкарбоксибетаин (цвиттерионные).
Используют также твины (оксиэтилированные эфиры ангидросорбита и ЖК: 40 – пальмитоил, 60 – стероил и 80 – олеил)
Из неорганических носителей можно отметить носители на основе: синтетических кремнезёмных сорбентов; металлов и их окислов (Fe, Al, Ni, Mn, Ti и Sn); глины, керамики, природные минералы, песок, активированный уголь.
Наиболее часто применяю носители на основе макропористых стекол и силикагелей. Недостатками их являются: повышенная растворимость при высоких рН растворов; малая механическая прочность; неспецифическая адсорбция. Их модифицируют для уменьшения растворимости так, чтобы на поверхности образовывалась пленка окислов металлов (Zr, Al и Ti). Главными достоинствами неорганических носителей являются: невысокая стоимость; возможность варьирования составом; высокая прочность.
Способы иммобилизации ферментов. Факторы, учитываемые при иммобилизации:
-природа функциональных групп белковых молекул;
-характеристика катализируемой реакции (природа субстрата);
-положение активного центра;
-наличие (отсутствие) простетических групп и других небелковых компонентов.
Физические и химические способы иммобилизации. К физическим способам относятся адсорбционные и механические. В первом случае, закрепление фермента на носителе происходит на его поверхности за счёт электростатических, гидрофобных, водородных связей и дисперсионных взаимодействий. Главное достоинство данного метода – возможность регенерации. Механические методы основаны на включении фермента (ферментного препарата) в гель, микрокапсулы, волокна, мембраны, двухфазные системы и т.д.
Физические методы наиболее часто применяются в промышленности. В качестве носителей в этом случае используют природные полимеры, полистиролы, полиакриламиды, ПАВ, неорганические носители. С помощью данного метода получены иммобилизованные амилазы, β- галактозидаза, глюкоамилаза, глюкозоизомераза, липазы, целлюлазы, каталаза и т.д.
Химические методы основаны на прикреплении фермента к носителю с помощью ковалентных связей. Преимуществами данной группы методов являются: прочность при различных рН, температуре (фермент не вымывается); возможность изменения свойств фермента (специфичность, активность, стабильность); меньшее влияние матрицы на фермент. К недостаткам относятся: частичная инактивация фермента при иммобилизации; сложность закрепления ферментов, имеющих кофакторы и субъединичное строение.
Способы прикрепления: Н – С – Ф; Н – Ф; С – Ф (Ф – С – Ф). В качестве сшивающих агентов используют глутаровый альдегид, галогенцианы (бромциан), изоцианиды, п- нитробензоилхлорид и др. Часто перед присоединением белка к носителю белок и носитель активируют, т.е. вводят реакционно-способные группы, по которым и будет в дальнейшем производиться сшивание.
С помощью химического метода иммобилизованы алкогольдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, каталаза, глюкозооксидаза, ксантиноксидаза, инвертаза и ряд других ферментов.
Современное направление иммобилизации ферментов и ферментных препаратов – иммобилизация целых клеток микроорганизмов, растений и животных как полиферментных систем.