Вопросы для подготовки к занятию.
Таксономия (систематика) микроорганизмов. Принципы классификации микроорганизмов. Классификация и номенклатура бактерий. Понятие о виде и штамме.
Морфология и строение бактерий: величина, основные формы, анатомия бактериальной клетки, ядерный аппарат бактерий и его отличия от ядер клеток более высокоорганизованных организмов, цитоплазма, рибосомы, мезосомы, эписомы, цитоплазматические включения, цитоплазматическая мембрана. клеточная стенка, слизистый слой (капсула), жгутики, бахромки, споры. Субклеточные формы бактерий: протопласты и сферопласты. L - формы бактерий. Фильтрующиеся формы бактерий и их отличия от вирусов.
Морфология и строение спирохет, их классификация. Сходства с бактериями и простейшими. Заболевания, вызываемые спирохетами.
Морфология и строение грибов. Их классификация и вызываемые заболевания.
Морфология и строение простейших, их классификация и вызываемые заболевания.
Морфология и строение риккетсий, их классификация и вызываемые заболевания. Сходства между бактериями и вирусами.
Морфология и строение вирусов. Классификация, величина вирусов и методы определения их размеров. Основные морфологические формы. Строение вириона. Внутриклеточные включения при вирусных заболеваниях и их характеристика. Морфология и строение микоплазмы.
Основные методы исследования морфологии микробов: микроскопия световая, фазовоконтрасная, люминесцентная, электронная. Иммерсионная система и её преимущества перед сухой. Исследование микробов в окрашенном состоянии, простые методы окрашивания /по Граму, Цилю-Нильсену, Ожешки, Нейссеру, Романовскому-Гимзе, Морозову и др./; приготовление красок: водного фуксина, фуксина Циля, раствора Люголя, генцианвиолета, уксуснокислой синьки Нейссера, синьки Леффлера, везувина, жидкости Руге, раствора танина, раствора серебра; негативные способы окраски препаратов; механизмы взаимодействия красителей и отдельных структур бактериальных клеток. Исследование микробов в живом состоянии: методы «висячей»* и «раздавленной капли».
№1. ОВЛАДЕНИЕ МЕТОДИКОЙ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ С ИММЕРСИОННОЙ СИСТЕМОЙ.
Перед работой проверяются части микроскопа, исправность и чистота оптической системы. В начале работы настраивается освещение, для чего необходимо поднять до отказа конденсор, полностью открыть диафрагму и установить плоское зеркало; затем повернуть револьвер и поставить объектив с малым увеличением (х 8), опустить его на расстоянии около 0,5 см от предметного столика. Смотря в окуляр, вращать зеркало до тех пор. пока не установиться предварительное освещение. Поле зрения должно быть освещено равномерно и ярко.
При микроскопировании с иммерсионной системой на приготовленный мазок при помощи тонкой стеклянной палочки наносят небольшую каплю кедрового масла, после чего препарат помещают на предметный столик и укрепляют зажимами.
Вращая револьвер установить объектив ОИ х 90 и, смотри сбоку, осторожно опускать с его помощью макрометрического винта до соприкосновения с маслом. Затем, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока появиться мелькание препарата. Окончательная фокусировка производиться микрометрическим винтом, который рекомендуется вращать в пределах одного оборота.
Окончательно отрегулировать освещение препарата.
Во избежании утомления глаз микроскопирование необходимо вести попеременно обоими глазами, не закрывая другого глаза.
Во время микроскопирования правой рукой производиться вращение микрометрического винта, пальцами другой руки - передвижение препарата.
Особое внимание должно быть обращено на чистоту оптики. Не следует начинать _ микроскопировать, не проверив чистоту зеркала, верхней поверхности линзы, конденсора и окуляра. Ни в коем случае нельзя прикасаться к поверхности линз руками, оставляющими на них отпечатки пальцев. При чистой оптике поле зрения должно быть совершенно чистым. Загрязнение на линзах окуляра обнаруживается при вращении окуляра, с которым с которым вращаются и частицы грязи.
По окончании работы микроскоп необходимо привести в порядок. Для этого необходимо приподнять тубус микроскопа, снять препарат, вытереть чистой тряпочкой масло с объектива, поставить объектив с малым увеличением, опустить конденсор, полностью открыть диафрагму и погрузить объектив в отверстие предметного столика.
При переносе микроскопа его необходимо брать за колонку и поддерживать другой рукой за подковообразную ножку.
№ 2. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ В ГОТОВЫХ ОКРАШЕННЫХ _ ПРЕПАРАТАХ (СТАФИЛОККОКА, СТРЕПТОКОККА, САРЦИНЫ, СЕННОЙ И КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧЕК И ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА).
Просмотренные бактерии зарисовывают в рабочую тетрадь цветными карандашами. Рисунки подписывают.
№ 3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТА (МАЗКА) ИЗ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫСТАФИЛОКОККА ИЛИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И ПРОСТАЯ ОКРАСКА.
Приготовление окрашенного преперата состоит из следующих этапов: а) приготовление мазка, б) высушивание, в) фиксация, г) окраска.
а) Для приготовления мазка наносят петлёй на обезжиренное предметное стекло небольшую каплю воды. В правую руку берут петлю, в левую - пробирку с культурой. Стерилизуют петлю, внося её в пламя горелки и держат вертикально, пока она не накалится докрасна; после этого держатель переводят в горизонтальное положение и подводят конец петледержателя через пламя. Вынимают пробку из пробирки, захватив мизинцем правой руки. Обжигают на спиртовке края пробирки. Вносят петлю в пробирку и охлаждают, касаясь ею стенок пробирки: затем петлёй с поверхности среды снимают очень небольшое количество культуры, не повреждая поверхности среды. При работе с бульонной культурой захватывают каплю материала. Петлю с культурой вынимают из пробирки, края последней ещё раз обжигают и закрывают отверстие пробкой. Захваченную петлёй культуру вносят в приготовленную каплю воды на стекле, хорошо размешивают и размазывают. Мазок должен быть тонким.
б) высушивание мазка производится на воздухе или для ускорения предметное стекло с мазком, обращённым кверху, можно подержать в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, но не вносить в огонь.
в) после высушивания производят фиксацию (прикрепление к стеклу) препарата.
Для этого стекло с мазком, обращённым кверху медленно проводят через пламя 3-4
раза. При этом микробы убиваются, приклеиваются к стеклу и не смываются при дальнейшей обработке.
г) после охлаждения стекла производится окраска препарата. Для этого на мазок пипеткой наносят каплю разведённой анилиновой краски (синька Леффлера или
водный фуксин) и концом пипетки распределяют её по всему мазку. Много краскисмывают водой, препарат высушивают фильтровальной бумагой. На мазок наносят капельку масла и исследуют с помощью иммерсионного объектива. Рассматривают отдельно лежащие клетки и зарисовывают.
№ 4. ОКРАСКА ПО ГРАМУ ЭМУЛЬСИЙ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ
И СТАФИЛОКОККА
1) На приготовленный мазок, высушенный и зафиксированный, налить пипеткой карболовый генциан-виолет и красить 1-2 минуты;
2) краску слить, препарат промыть водой;
3) налить раствор Люголя на 1 минуту, после чего мазок приобретает буроватый оттенок;
4) слить раствор Люголя;
5) налить на препарат 96% спирт и обесцвечивать до прекращения отхождения фиолетовых струек краски;
6) хорошо промыть водой;
7) докрасить водным фуксином 1-2 минуты (можно эозином или везувином);
8) промыть водой, высушить.
Грамположительные бактерии (стафилококки) окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные (кишечная палочка) - в красный. Удобной модификацией является способ Синева, при котором пользуются заранее приготовленными полосками фильтровальной бумаги, пропитанной генцианвиолетом и высушенной. Эти полоски кладут на фиксированный мазок, на который предварительно наносят 2-3 капли воды.
В остальном техника окраски похожа на способ окраски по Граму.
№ 5. ОКРАСКА ПО НЕЙССЕРУ ДИФТЕРИЙНОЙ ПАЛОЧКИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВКЛЮЧЕНИЙ (ЗЕРЕН ВОЛЮТИНА)
1) На фиксированный препарат налить уксусно-кислой синьки (синька Нейссера): окрашивать 2-3 минуты;
2) смыть краску водой;
3) налить раствор Люголя на 20-30 секунд;
4) докрасить водным раствором везувина в течение 0,5-1 минут;
5) промыть водой;
Протоплазма микробной клетки окрашивается в жёлтый цвет, зерна волютина - в черный и темно-синий.
№ 6. ОКРАСКА ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ МОКРОТЫБОЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЁЗОМ.
1) На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги (величиной не больше предметного стекла) и наливают карболовый фуксин Циля или накладывают заранее заготовленную пропитанную фуксином и высушенную бумагу предварительно нанося на мазок 2-3 капли воды.
2) Мазок с краской 2-3 раза подогревают, держа высоко над пламенем горелки до появления паров и каждый раз отставляя препарат в сторону до охлаждения (наблюдать за появлением паров, глядя на мазок сбоку, а не сверху).
3) Дают препарату остыть, снимают бумажку, сливают краску и промывают
препарат водой.
4) Обесцвечивают препарат 5% серной кислотой (погружают в стаканчик с
кислотой 2-3 раза, не задерживая в кислоте).
5) Препарат тщательно промывают водой.
6) Докрашивают метиленовой синей 3-5 минут.
Кислоустойчивые бактерии рубиново-красные, остальные части мазка, в том числе некислоустойчивые бактерии - синие.
№ 7.ОКРАСКА СПОР АНТРАКОИДА ПО СПОСОБУ ОЖЕШКИ.
Высушенный препарат обрабатывают в течение 2 минут горячим 0,5% раствором соляной кислоты, промывают, высушивают, фиксируют на огне и красят по Циль-Нильсену.
В препарате видны синие палочки и лежащие внутри их красные споры.
№ 8. ОКРАСКА ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫПО МОРОЗОВУ.
1) Мазок покрывают на 1 минуту жидкостью Руге (100 мл дистиллированной
воды + 1 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл продажного формалина).
2) Сливают жидкость Руге и наливают на мазок раствор танина (100 мл
дистиллированной воды + 5 г танина + 1 мл расплавленной кристаллической
карболовой кислоты). Подогревают мазок до появления паров 1-2 мин. После этого тщательно промывают мазок дистиллированной водой.
3) Обрабатывают мазок в течение 1-2 минуты раствором серебра (в 100 мл
дистиллированной воды растворяют 5 г азотнокислого серебра и отливают 20 мл. К оставшимся 80 мл раствора прибавляют по каплям крепкий раствор аммиака до тех пор, пока не растворится образующийся осадок, после чего раствор слегка
опалесцерует). При легком подогревании препарат окрашивается в темно-
коричневый цвет. Под микроскопом элементарные тельца имеют почти чёрный цвет.
При обработке по способу Морозова вирус оспенной вакцины достигает размера 0,2 микрон и имеет кокковидную форму.
№ 9. ИЗУЧЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ МЕТОДОМ
«РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ»
На поверхность чистого предметного стекла наносят каплю физиологического раствора и вносят в неё культуру кишечной палочки со скошенного агара. Покрывают каплю чистым покровным стеклом. Капля не должна выходить из под краёв покровного стекла. Излишнюю жидкость снимают фильтровальной бумагой. На поверхность покровного стекла наносят масло и рассматривают препарат с иммерсионной системой. Обращают внимание на форму микробов и характер движения.
№ 10. ИЗУЧЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ МЕТОДОМ
«ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ».
Используют стекла с лункой и покровные стекла. Края покровного стекла смазывают везелином, а в центр наносят одну каплю физиологического раствора и вносят в неё культуру кишечной палочки. Затем предметное стекло лункой вниз прижимают к покровному стеклу, так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь её дна или края. Микроскопируют с иммерсионной системой.
№11. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И МИКРОСКОПИЯ МАЗКОВ ИЗ НИТЧАТЫХ (ПЛЕСНЕВЫХ) ГРИБОВ МУКОРОВОЙ, АСПЕРГИЛЛОВОЙ И ПЕНИЦИЛЛИНОВОЙ ПЛЕСЕНЕЙ.
В каплю воды на предметном стекле вносят небольшую частицу культуры грибка и покрывают стеклом. Микроскопируют с сухой системой, пользуясь увеличениями: 8 х или 40 х. Обращают внимание на ветвящийся мицелий, на грифы (одно и многоклеточные), на форму плодоносящих тел. У мукоровых плесеней мицелий одноклеточный, спороганглий шаровидный на ножке, наполнен эндоспорами. У аспергилловых плесеней - мицелий многоклеточный, от мицелия поднимается одноклеточный конидиеносец, шаровидно утолщающийся на конце с веерообразно расположенными конидиями на нем (личная плесень). У пеницилловых -многоклеточный кондиеносец и плодоносящее тело в виде кисточки с конидиями (кистевик).
№ 12. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ ДРОЖЖЕЙ. ВИТАЛЬНАЯ ОКРАСКА.
Петлей захватывают каплю взвеси дрожжей и наносят на предметное стекло. Петлю обжигают. Каплю осторожно покрывают покровным стеклом, избегая попадания под него пузырьков воздуха. Рассматривают препарат с сухой системой при слегка опущенном конденсоре и зарисовывают его в тетрадь.
Наносят на предметное стекло около края покровного небольшую каплю раствора метиленовой синей. Жидкость, проникающая под покровное стекло, достигает капли дрожжевой взвеси; краска постепенно диффундирует в препарат и окрашивает клетки. Наблюдают за этим процессом, обращают внимание на форму клеток, неравномерное окрашивание разных дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток. Зарисовывают препарат вторично.
№ 13. МАКРО- И МИКРОСКОПИЯ ОКРАШЕННЫХ ПО ГРАМУ КУЛЬТУР
ГРИБКОВ КАНДИДА.
Готовят мазок из агаровой культуры гриба кандида и красят его по Граму, микроскопируют с иммерсионной системой. Обращают внимание на грамположительные клетки круглой или овальной формы размером 2-5 микрон. Зрелые клетки крупнее, принимают удлинённую форму размером до 12-16 микрон, располагаются длинными цепочками, которые образуют так называемый псевдомицелий (настоящего мицелия дрожжеподобные грибки не имеют). Псевдомицелий отличается от истинного мицелия тем, что не имеет общей оболочек и перегородок, а состоит из длинных и тонких клеток, образующихся путём последовательного бокового или концевого почкования. Наружных спор, типа конидий, и внутренних спор, типа оскоспор, дрожжеподобные грибки не образуют, чем и отличаются от других грибков. Некоторые виды кандида образуют хламидоспоры, диаметром 10-20 микрон круглой формы, с толстой двухконтурной оболочкой. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укреплённых клеток, называемых протохламидоспорами. Препарат зарисовывают в тетрадь.
ДЕМОНСТРАЦИЯ.
1. КАПСУЛЫСИБИИРИЯЗВЕННЫХ ПАЛОЧЕК
(ОКРАСКА ПО ГРАМУ).
При микроскопии видны грамположительные палочки, расположенные в виде цепочек и окруженные неокрасившейся капсулой (в виде белого ободка).
2. КАПСУЛЫПНЕВМОКОКОВ (ОКРАСКА ПО ГРАМУ).
В препарате видны грам-положительные ланцетовидные диплококки, окружённые неокрасившимися капсулами.
3. БОРРЕЛИЯ ОБЕРМЕЙЕРА В КРОВИ БОЛЬНОГО ЭПИДЕМИЧЕСКИМИ
ВОЗВРАТНЫМ ТИФОМ. ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕ.
Препарат готовят так: на чистое обезжиренное стекло ближе к одному из его концов помещают каплю крови. Другое предметное стекло, имеющее шлифованный край, прижимают под углом 45 к капле крови, а затем скользящим движением передвигают его к свободному концу первого стекла. При этом кровь размазывается по предметному стеклу тонким слоем. Высушивают препарат только на воздухе, фиксируют в жидком фиксаторе (смесь этилового спирта и эфира).
Затем препарат окрашивают по методу Романовского-Гимза. Краска Романовского-Гимза состоит из метиленовой синьки, эозина и азура. Техника окрашивания: на мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли продажного красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 минут. Препарат осторожно споласкивают водой и высушивают на воздухе. Спирохеты возвратного тифа видны среди эритроцитов виде тонких нитей, имеющие 3-5 крупных завитков. Длина тела спирохеты 15-20 микрон, т.е. в 2-2,5 раза превосходит диаметр эритроцита. В препарате, окрашенном по _ Романовскому-Гимзе спирохеты возвратного тифа имеют фиолетовый цвет, эритроциты крови - розовый, ядра лейкоцитов - фиолетовый.
4. БЛЕДНАЯ ТРЕПОНЕМА. ОКРАСКА ПО БУРРИ.
Для приготовления препарата на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней каплю материала, содержащего бледную трепонему. Обе капли тщательно, но быстро (чтобы не дать им высохнуть) перемешивают. Из полученной смешанной капли приготавливают мазок, таким образом, как из капли крови. Когда мазок высохнет, на него наносят каплю кедрового масла и рассматривают его с иммерсионной системой. В препарате видны на темном фоне бесцветные возбудители сифилиса в виде тонких нитей с 8-12 равномерными мелкими завитками.
5. Трипаносомы. Окраска по Романовскому Гимзе.
6. ЛЕЙШМАНИИ. ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕ
7.ТОКСОПЛАЗМЫ.ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕ
8. РИККЕТСИИ ПРОВАЧЕКА. ОКРАСКА ПО
РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕ.
Все просмотренные препараты зарисовываются в тетрадь цветными карандашами. Каждый рисунок надо снабдить подробной подписью с указанием структуры
видимых деталей рассматриваемых микроорганизмов.
ТЕМА: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Лабораторная работа.
№1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МЯСО-ПЕПТОННОГО БУЛЬОНА (МПБ)
МПБ готовится из мясной воды с добавлением 0,5 % хлористого натрия и 1 % пептона.
Этапы
1) Приготовление мясной воды: а) 1 кг говяжьего мяса высшего сорта (без
костей, жира и сухожилий) пропускают через мясорубку; б) наливают
двойным объёмом водопроводной воды и оставляют на 1 сутки в холодном
месте или на 2 часа при 37. в) отжимают через марлю; г) кипятят 5 минут,
дают остыть; д) фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до
первоначального объема.
2) Приготовление МПБ
а) к мясной воде добавляют 1 % пептона и 0,5 % хлористого натрия при
подогревании и постоянном его помешивании.
б) устанавливают слабощелочную реакцию при помощи лакмусовой бумажки
(коррегируют едким натром) красная бумажка должна посинеть.
в) кипятят 30-45 минут.
г) остужают, фильтруют через бумажный фильтр и доводят до
первоначального объема дистиллированной водой.
д) устанавливают рН с помощью компаратора Михаэлиса и с помощью
щелочи доводят рН до 7,4-7,6.
е) снова кипятят, остужают, фильтруют.
ж) разливают и стерилизуют 20 минут в автоклаве при температуре - 120°.
№ 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МЯСО - ПЕПТОННОГО АГАРА (МПА)
а) к МПБ добавляют 2-3 % агар-агара
б) остужают до 50
в) иногда для просветления среды добавляют белок одного куриного яйца,
тщательно смешанный с двойным количеством холодной воды.
г) помещают в автоклав на 45 минут при 115° для осаждения (хлопья
свернувшегося белка адсорбируют все взвешанные частицы).
д) фильтруют через ватный фильтр
е) разливают
ж) стерилизуют в автоклаве 15-20 минут при температуре 120°.
з) приготавливают в пробирках скошенный (остужают в пробирках в
наклонном положении (и прямой агар) помещают в штатив в вертикальном
положении).
№3. ОСВОЕНИЕ ТЕХНИКИ ПОСЕВА НА ПЛОТНЫЕ
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.
ПОСЕВЫНА ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.
Основным и непременным условием при посеве является сохранение чистоты культуры. Для этого необходимо соблюдение всех деталей техники посева, обеспечивающих стерильность. Посевы производят непосредственно около зажженной горелки, в пламени которой стерилизуется петля, обжигаются края пробирки, когда её открывают и закрывают, а также пробки пробирок, вынимаемые при посеве. Чтобы не внести микробов из воздуха, все движения руки должны быть быстрыми, точными. Пробирки нужно держать сильно наклоненными. При посеве нельзя разговаривать, кашлять, т.к, при этом могут попасть микробы изо рта. Не должно быть хождений. Самым частым методом пересева бактерий является посев в пробирку со скошенным агаром. Он производится следующим образом:
1) Пробирку с чистой культурой на скошенном агаре берут в левую руку в
наклонно-горизантальном положении между большим и указательным
пальцами. Скошенная поверхность агара повёрнута к глазам и должна быть
видна. Рядом с этой пробиркой берут пробирку с незасеянной средой.
2) Обжигают петлю правой рукой.
3) Мизинцем правой рукой захватывают наружные концы ватных пробок,
прижав их к ладонной поверхности руки, и вынимают пробки из прббирок.
4) Обжигают края пробирок на пламени горелки.
5) Вводят петлю в пробирку с культурой. Прикоснувшись петлей к участку
среды, свободному от посева, убеждаются, что петля остыла (агар не должен
«кипеть» под петлёй); берут полную петлю культуры.
6) Быстро наносят петлю с взятым материалом в пробирку с питательной
средой, не задевая краев и стенок обеих пробирок.
7) Опускают петлю до конденсационной воды, находящейся на дне
пробирки, и делают посев культуры на скошенный агар одним из трёх
способов: а) посев чертой, б) посев штрихом, в) сплошной посев.
8) Вынимают петлю из пробирки. Быстро обжигают края пробирок,
внутренние концы пробок и закрывают пробирки (не дуть на случайно
загоревшиеся пробки).
9) Тщательно прокаливают пробирку этикируют. Посев помещают в
термостат.
№ 4. ОСВОЕНИЕ ТЕХНИКИ ПОСЕВА НА ЖИДКИЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Техника посева в основном та же, что и на плотные среды, необходимо обратить внимание на следующие моменты:
1)Не допускать, чтобы питательные среды выливались при горизонтальном
положении пробирок.
2)Не допускать, чтобы края пробирок и ватные пробки смачивались
средой.
3)При пересеве с жидкой питательной среды на жидкую можно пользоваться петлёй, стерильной градуированной или стерильной пастеровской
пипеткой. Капилляр стерильной пастеровской пипетки отламывают
прокаленным пинцетом и слегка обжигают. Материала набирают
насасыванием. После пипетки немедленно помещают в дезинфицирующий
раствор.
№ 5. ПОСЕВ УКОЛОМ В СТОЛБИК АГАРА
Чаще применяется для культивирования анаэробов. При посеве уколом пробирки со средой держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают края пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают прокалённой длинной платиновой (петлей) иглой и прокаливают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до дна пробирки. Иглу вынимают, обжигают края пробирки и пробки, закрывают пробирку, иглу обжигают и ставят в штатив. Пробирку с посевом этикируют и помещают в термостат.
№ 6. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ВИРУСОВ ИЗ ПОЧКИ ОБЕЗЬЯНЫ
(разбор схемы).
Для выращивания вирусов употребляют суспензию клеток, полученную путём обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин и др.). Трипсинизацией достигается получение отдельных клеток или небольших агрегатов их путём переливания трипсином межклеточного склеивающего белкового вещества.
При получении трипсинизированной культуры клеток из почки обезьяны, почку разрезают пополам и забирают корковый слой. В дальнейшем придерживаются следующей схемы:
1)Ткань измельчают стерильными ножницами на кусочки величиной 2-3 мм.
2)Обрабатывают раствором трипсина. При этом пользуются магнитной
мешалкой, чтобы кусочки ткани равномерно премешивались.
3)Полученную суспензию клеток центрифугируют, надосадочную жидкость
сливают, а осадок клеток ресуспендируют в питательной среде, подогретой
при 37°, и сливают в бутыль через 2-3 слоя марли.
4)Производят подсчёт клеток в счётной камере Горяева (подсчитывают
клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму). Вычисляют количество
клеток, содержащихся в 1 мл.
5)Добавляют в матрац к помещенной туда клеточной суспензии
питательную среду, чтобы в 1 мл содержалось необходимое количество клеток
(200000-400000 и более).
№ 7. ЗАРАЖЕНИЕ ВИРУСОМ ОСПОВАКЦИНЫХОРИОНАЛЛАНТОИСНОЙ ОБОЛОЧКИ
КУРИНОГО ЭМБРИОНА.
Первый этап:
Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12 дневного возраста. Перед заражением куриных эмбрионов необходимо удостовериться в их жизнеспособности. Для этого употребляется овоскоп. Отобранное для работы яйцо помещается в отверстие овоскопа над источником света. При этом скорлупа просвечивают и отчетливо становится видным эмбрион, сосуды хорионаллантоисной оболочки и границы воздушного мешка. Если эмбрио жизнеспособен, он подвижен, кровеносные сосуды заполнены кровью и пульсируют. В случае гибели эмбриона, сосуды запустевают, самостоятельные движения не наблюдаются. На скорлупе яйца отмечают простым карандашом границы воздушного мешка. Для заражения яйцо помещается на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху; поводится тщательная стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности; спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием. Затем над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы. В образовавшиеся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе величиной около 1,5 см в диаметре (при этом нельзя допускать попадания обломков скорлупы внутрь яйца). Через сделанное отверстие виден внутренний листок подскорлупной оболочки. Его осторожно надрывают глазным пинцетом или иглой и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см), обнажив хорионаллантоисную оболочку. После этого производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на нее 0,1-0,2 мл суспензии вируса осповакцины с помощью пастеровкой пипетки или шприца. Окошко в скорлупе закрывают стерильным стеклянным колпачком или покровном стеклом. Для прикрепления их к скорлупе пользуются расплавленным парафином. Прежде чем наложить стеклянный колпачок или покровное стекло, рекомендуется сделать валик из расплавленного парафина вокруг отверстия, а затем закрыть его нагретым колпачком или покровном стеклом. Заражённый эмбрион помещают в штатив в ^вертикальном положении и ставят в термостат на 2-3 суток.
Второй этап:
Яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху. Перед вскрытием скорлупу по краю соприкосновения с колпачком дезинфицируют последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием. Осторожно очищают парафин и удаляют колпачок или покровное стекло, затем стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства. При помощи пинцета снимают подскорлупную оболочку. Обнаженную хорионаллантоисную оболочку, на которой должны быть видимые изменения в виде белых бляшек, подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают все содержимое яйца в чашку. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку Петри с физиологическим раствором. Там ее расправляют, тщательно промывают несколько раз физ. раствором и изучают макроскопические изменения, поместив чашку на темный фон. Затем изучают микроскопически. Для этого из кусочков хорионаллантоисной оболочки, где имелись бляшки, готовятся мазки путём растирания их по стеклу и окрашивания по Морозову. Препараты микроскопируют. Вся отработанная посуда сдается дежурному лаборанту.
N° 8. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫКИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ ИЗ ЕЕ СМЕСИ СО СТАФИЛОКОККОМ ПО СПОСОБУ ДРИГАЛЬСКОГО.
Чистая культура кишечной палочки, как правило, выделяется на 3-й день. Работу первого дня составляют:
а) приготовление мазков из данной смеси микробов и окраска по Граму.
микроскопом видны грамотрицательные кишечные палочки и
грамположительные стафилококки.
б) Рассев смеси на чашку с МПА шпетелем. Мы засеваем несколько
измененным методом Дригальского. Для этого на поверхность питательной
среды в чашке наносят петлёй или стерильной пастеровской пипеткой каплю
исследуемого материала. Её растирают прокаленным и охлажденным шпателем
сначала на небольшом участке, затем этим же шпателем на втором и, наконец,
на третьем участке чашки (вместо 3-х чашек с МПА берем одну). Чашку надписывают (фамилия студента, номер группы, дата) и ставят в специальный цилиндр вверх дном, чтобы образующиеся капельки паров воды, попадающие на крышу, не стекали на поверхность среды и не размазывали посева. Чашки ставят в термостат на 18-24 часа.
Работу второго дня составляют:
а) Изучение колоний,
б) выделение чистых культур.
Для этого засеянную чашку вынимают из термостата и изучают полученный посев. На первом участке, где было много материала, получается сплошной рост бактерий и отдельных колоний не видно. На втором участке и в особенности на 3-м колонии распределяются изолированно, поэтому легко доступны исследованию. Прежде всего, изучают колонии микроскопически, невооруженным глазом. Просматривают чашку (не открывая) со стороны дна в проходящем свете, держа ее на уровне глаз на расстоянии 20-30 см. Видно, что посев смеси дал рост неоднородных колоний. Колонии стафилококка выпуклые, гладкие, блестящие, с ровным краем, размером 1-4 мм в диаметре, прозрачные, золотистые или белого цвета.
Колонии кишечной палочки слабо выпуклые, полупрозрачные, сероватого цвета, с ровным краем и гладкой блестящей поверхностью, размером 2-3 мм в диаметре.
Колонии можно просмотреть с помощью лупы или под микроскопом (при малом увеличении) при этом лучше видна разница в структуре колоний.
Выбирают изолированные колонии того и другого микроба, из части каждой колонии делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Убеждаются, что золотистого цвета колонии содержат стафилококки (кокки располагаются скоплениями, грамположительны), а серого цвета колонии-кишечные палочки (беспорядочно расположенные, грамотрицательные палочки). Остаток колонии кишечной палочки пересевают в пробирку с косым агаром. К пробирке прикрепляют этикетку с указанием даты посева, группы, фамилии студента и ставят её в термостат при 37° на 18-24 часа.
Работу третьего дня составляет проверка чистоты культуры. Для этого через сутки пробирки с посевами вынимают из термостата и убеждаются сначала микроскопически, что в них получен рост однородной культуры. Кишечная палочка на скошенном агаре растет в виде сочного, блестящего, полупрозрачного налёта серого цвета. Затем готовят мазок, окрашивают его по Граму и просматривают под микроскопом (не менее 10 полей зрения). Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально (в нашей работе культура должна состоять только из грамотрицательных палочек среднего размера). Ход работы и результат учащиеся отмечают в рабочей тетради.
№ 9. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АНАЭРОБОВ.
Выделение чистых культур анаэробов изучаем на примере выделения Bac. Perfringens из раневого отделяемого при подозрении на газовую гангрену.
Работа расчитана на 4 дня.
Работа первого дня составляют:
а) микроскопия раневого отделяемого. Для этого микроскопом крупных
грамположительных палочек, часть которых имеет капсулу (Bac. Perfringens)
позволяет заподозрить газовую инфекцию.
б) посев раневого отделяемого на регенерированную среду Китт-Тароцци.
Посев помещают в термостат на 18-20 часов.
Работа второго дня составляют:
а) изучение характера роста на среде Китт-Тароцци. При наличии Bac. Perfringens она мутнеет и в ней образуется газ. Приготовляются мазки из
бульонной культуры и окрашиваются по Граму. Под микроскопом
отыскиваются крупные грамположительные палочки.
б) для выделения чистой культуры анаэробов в чистом виде производят
пересев по методу Перетца: в пробирку с растопленным и остуженным до 45°
сахарным агаром вносится и размешивается часть бульонной культуры со
среды Китт-Тароцци. Смесь выливается в стерильную чашку Петри,
охлаждается. На поверхность накладывается стерильное стекло, под которым
создаются анаэробные условия. Чашку в закрытом виде помещают в термостат
на 18-20 часов.
Работу 3-го дня составляют:
а) макроскопическое изучение выросших под стеклом колоний анаэробов;
б) приготовление из подозрительных колоний мазков и окрашивание их по
Граму. Под микроскопом отыскивается крупные грамположительные палочки;
в) остаток колонии, подвергшейся микроскопическому изучению, отсевают
на среду Китт-Тароцци для получения чистой культуры;
Работу 4-го дня составляют
а) приготовление мазков со среды Китт-Тароцци и окрашивание их по Граму для проверки выделенной культуры на чистоту.
№ 10. ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ (на примере кишечной палочки).
а) Сбраживание углеводов.
Способность разлагать различные углеводы (как принято называть «сахара») с образованием альдегидов, кислот, газообразных продуктов (СО2, Н2, СН4) обнаруживается при посеве на жидкие среды Гисса с различными углеводами (лактоза, сахароза, маннит, мальтоза, глюкоза и др.) и реактивом Андреде или лакмусовой настойкой в качестве индикатора. В пробирки со средой помещают «поплавки» - стеклянные трубочки, запаянные с одного конца, для обнаружения газа. Работа расчитана на 2 дня.
Работа первого дня составляет посев чистой культуры кишечной палочки на среды Гисса с лактозой, сахарозой, глюкозой, маннитом и мальтозой (большой «пёстрый» ряд). К первой пробирке прикрепляют этикетку с указанием номера
группы и фамилией студента. Посевы ставят в термостат при 37° на 18-20 часов.
Работу второго дня составляет изучение посевов на средах Гисса.
Кишечная палочка, обычно, разлагает лактозу, глюкозу, манит, мальтозу до кислоты и газа и не разлагает сахарозу. При разложении Сахаров обнаруживается покраснение индикатора вследствие образования кислот при разложении углевода. В верхней части поплавка среда вытеснена газом. Среда с сахарозой цвета не изменяет, поплавок заполнен питательной средой вследствие отсутствия газообразования.
^/б) РАСЩЕПЛЕНИЕ БЕЛКОВ
Разложение микробами белка сопровождается образованием индола, сероводорода, аммиака.
Проба на индол: петлю исследуемой культуры кишечной палочки засевают в пробирку с мясо- пептонным бульоном, приготовленном на переваре Хоттингера и инкубируют в термостате 48-72 часа при 37°. Затем приливают 2-3 мл эфира. Смесь тщательно перемешивают, дают отстояться, при этом индол, содержащийся в культуре экстрагируется эфиром и всплывает кверху. После этого осторожно по стенке пробирки наслаивают 5-8 капель реактива Эрлиха (парадиметиламмидобензальдегид - 1 г, этиловый спирт - 96° - 95 мл, концентрированная соляная кислота - 20 мл) и в течение ближайших 5 минут учитывают результат. Окрашивание эфирного слоя в малиново-красный цвет свидетельствует о положительной реакции на индол.
Проба на сероводород:
Петлю исследуемой культуры кишечной палочки засевают в пробирку с МПБ и помещают в неё полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченную уксуснокислым свинцом и высушенную. Полоска бумаги прижимается пробкой к стенке. Посев ставят в термостат на 18-20 часов. В положительном случае образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным уксуснокислым свинцом, превращаясь в сернокислый свинец, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.
ДЕМОНСТРАЦИЯ
1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ГОТОВЫМИ ЭЛЕКТИВНЫМИ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫМИ
ПИТАТЕЛЬНЫМИ СРЕДАМИ
КРОВЯНОЙ АГАР. Употребляется чаще всего для выявления гемотоксических свойств микроба. Является также хорошей питательной средой для патогенных микробов, требующих при росте на искусственной среде добавления субстратов животного происхождения.
Способ приготовления:
1)Распла