В предыдущих главах мы уже неоднократно упоминали Сa2+, и будем делать это и в последующих главах. Существует огромный массив данных, свидельствующий об участии ионов кальция в регуляции множества внутриклеточных процессов. Известен целый список белков, активность или локализация которых зависит от связывания с Сa2+. С очень небольшой долей преувеличения можно сказать, что какой бы процесс не изучал исследователь, рано или поздно он столкнется с этим вездесущим ионом. С проблемами кальциевой сигнализации связана обширная область исследований. Эти исследования привели к формированию модели, в соответствии с которой эффекты Сa2+ основаны на том, что уровень свободных ионов в цитоплазме весьма низок (сотни наномолей), тогда как во внеклеточной среде – на несколько порядков выше. Также высок уровень Сa2+ в так называемых кальциевых депо – митохондриях и ЭПР. Изменения уровня цитоплазматического кальция приводит к активации Сa2+-связывющих белков и регулируется внешними сигналами, которые могут модулировать активность кальциевых каналов. Такими сигналами могут быть изменения потенциала мембраны, активация ростовыми факторами фосфолипазы С и др. Изменения уровня Са2+ в цитоплазме осуществляется за счет работы кальциевых каналов разной степени селективности, как регулируемых (например, потенциалом мембраны, ассоциацией с NAADP, уровнем рН в органелле и т. д.), так и каналов утечки, и различных транспортеров. В результате даже массированный вход Сa2+, приводящий к тотальному увеличению его концентрации в цитоплазме, может быть быстро нивелирован за счет его выброса в окружающую среду и обратной закачки в депо.
В рамках нашей темы особенно важен такой аспект, как влияние кальция на слияние мембран. Ключевая роль этих ионов в слиянии синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной или при регулируемом экзоцитозе в электроневозбудимых клетках надежно установлена уже довольно давно. Использование внутриклеточных хелаторов Сa2+ позволило выявить зависимость от кальция и гомотипических слияний СОРII-везикул и эндосом друг с другом и с лизосомами.
К началу 2000-х годов стало казаться, что необходимость повышения уровня кальция для слияния мембран является универсальным, и кальций-независимых механизмов слияний просто не существует. Такая ультимативность предполагает и существование универсального же молекулярного механизма, посредством которого Сa2+ действует при слиянии. Интрига, однако, заключается в том, что такого механизма до сих пор обнаружить не удалось. Это означает, что на вопрос о том, как именно кальций регулирует слияние мембран, нет общего ответа. Еще одна проблема связана с тотальным характером изменений уровня кальция. Действительно, если активация фосфолипазы С приводит к появлению InsP3, продукта гидролиза фосфатидилинозитолфосфата, который стимулирует открытие кальциевых каналов во внутриклеточных депо и приводит к их массированному опустошению, то такое тотальное повышение уровня Сa2+ должно приводить к слиянию «всего со всем». Этого, однако, не происходит. Если такое тотальное увеличение концентрации кальция еще можно привязать к ранней стадии множественных слияний эндосом при стимуляции эндоцитоза рецепторов ростовых факторов, многие из которых стимулируют фософолипазу С, то остается неясным, как быть с поздними стадиями, тотальный уровень кальция уже вернулся к норме, а в клетке остается менее десятка поздних эндосом, и только их слияние с лизосомами необходимо организовать «в нужное время в нужном месте»?
Исследования последних лет внесли некоторую ясность в эти вопросы. Так, при сравнении действия двух внутриклеточных кальциевых хелаторов, BAPTA и EGTA, которые (при использовании в концентрации 10 мМ) гасят типичный кальциевый градиент за 0,3 микросекунды и 1,2 миллисекунды, соответственно, было показано, что быстрый хелатор BAPTA подавляет слияния эндосом и COPII-везикул, тогда как медленный ― нет. Следовательно, для эффективного слияния повышение уровня Сa2+ требуется на время меньше 1 миллисекунды. Это также означает, что источник кальция (т. е. открытый канал) должен находиться на расстоянии порядка 20 нм от объекта влияния, которым, очевидно, должна быть машинерия, связанная со слиянием. В связи с этим появилась гипотеза, в соответствии с которой докинг комплекса SNARE стимулирует выброс Сa2+, а он, в свою очередь, активирует некие Сa2+-связывающие белки, которые и регулируют слияние. Однако, остается все равно непонятным, как именно они это делают. Тем не менее, эта гипотеза оказалась очень полезной, поскольку, во-первых, направила усилия исследователей на поиски таких белков среди регуляторов слияния и, во-вторых, позволила предположить, что для слияния важно не столько тотальное, сколько локальное изменение уровня кальция. Выявление кальциевых каналов нескольких типов в мембранах эндосом и лизосомах, транспортных везикулах биосинтетического пути, а также измерения уровня внутривезикулярного кальция показали, что эти везикулы сами в состоянии обеспечивать как раз то быстрое и локальное повышение уровня этого иона (в непосредственной близости от внешней стороны везикулярной мембраны), которое может служить триггером слияния. Регулируемые каналы (например, рН-чувствительные) могут давать «квантованные» выбросы кальция, тогда как каналы утечки приводят к формированию определенного относительно стабильного градиента, окутывающего всю везикулу.
Поиски по «белковому направлению» дали хотя и немногочисленные, но весьма неожиданные результаты. Так, анализ процесса экзоцитоза в синапсах, опосредуемый синаптотагмином, показал, что этот белок, имеющий 2 кальций-связывающих С2-домена, стабилизирует SNARE-комплекс до момента выброса Сa2+ через ассоциированный со SNAP25 канал, после чего связывает Сa2+ и изменяет свою конформацию таким образом, что частично погружается в мембрану, способствуя быстрой реорганизации липидов. Сам он после этого диссоциирует с мембраны, что и прекращает дальнейшие слияния. Можно предполагать, что его изоформы, действующие в электроневозбудимых клетках, работают подобным же образом. В этом случае Сa2+ выступает в роли позитивного регулятора слияния.
На эндоцитозном пути также удалось обнаружить белок, функцинирование которого опосредуется Сa2+, однако картина оказалась весьма неожиданной. Этим белком оказался HRS – компонент первого из сортирующих комплексов ESCRT, ответственных за направление грузов по пути лизосомной деградации. Анализ структуры HRS показал, что он может напрямую взаимодействовать с Q-SNARE SNAP-25 за счет своего SNARE-подобного суперскрученного домена, препятствуя формированию комплекса слияния с синтаксином-13 и подавляя связывание c R-SNARE VAMP2. Это ингибиторное взаимодействие существует до тех пор, пока не происходит выброс кальция из эндосом, в результате чего HRS высвобождается из комплекса, освобождая путь для SNARE-опосредуемого слияния. Таким образом, в данном случае кальциевый сенсор скорее является протектором несанкционированного слияния, которое могло бы произойти и в отсутствие кальция. Время выброса Сa2+ из эндосом, в свою очередь, определяется моментом достижения определенного уровня рН (6,2–6,7) за счет работы вакуолярной помпы.
На ранних эндосомах выявлен еще один Сa2+-связывающий белок, кальмодулин. Он взаимодействует как со SNARE синтаксином-13 и VAMP2, так и с фактором дистанционного взаимодействия ЕЕА1. Существуют данные в пользу регуляции слияния ранних эндосом кальмодулин-зависимой протеинкиназой II, однако ни функция, ни механизм действия кальмодулина в данном случае неизвестны.
На биосинетическом пути компонентами транспортной машинерии, зависимой от Сa2+, оказались некоторые белки окаймлений COPI и COPII. Интересно, что связывание кальция стабилизирует эти окаймления. Как это может повлиять на транспорт? Во-первых, стабилизация окаймлений может способствовать формированию транспортных пузырьков или препятствовать их обратным слияниям. Во-вторых, даже на стадии взаимодействия с ERGIC везикулы могут сохранять часть окаймления, однако и в этом случае нельзя сказать, ингибиторное или стимулирующее действие на слияния будет оказывать Сa2+. В настоящий момент очевидно одно – универсального механизма регуляции кальцием слияния мембран не существует. Более того, оказывается, что некоторые стадии транспортных процессов, например транспорт из ЭПР в ERGIC, в отличие от слияний между ERGIC и АГ, не подавляются быстрым хелатором кальция BAPTA-AM. C высокой степенью вероятности, существуют и другие стадии транспортных путей, на которых слияния не зависят от кальция.
Тем не менее, даже то, что мы знаем сейчас, позволяют рассматривать Сa2+, такой на первый взгляд универсальный агент, как разнонаправленный регулятор слияний, использующий различные механизмы. Действуя в основном локально, он способен вносить существенный вклад в специфичность транспортных процессов.
5. RAB-БЕЛКИ КАК «ТОП-МЕНЕДЖЕРЫ»
КЛЕТКИ
Как уже упоминалось, первоначально Rab-белки рассматривались только как регуляторы слияния мембран в ходе везикулярного транспорта,. Однако, с течением времени оказалось, что их роль в жизни клетки гораздо шире. Так, кроме слияний, эти белки вовлечены в транспортировку везикул, опосредуя их перемещение с помощью цитоскелета. Но еще более важной является их роль в организации доменной структуры мембран тех компартментов, на которых они локализуются. Их участие сразу в нескольких процессах позволяет координировать многие внутриклеточные события во времени и в пространстве, за что Rab-белки получили название «топ-менеджеров» клетки: фактически не делая ничего «руками», они руководят если не всем, то очень многим.
5.1. РОЛЬ RAB-БЕЛКОВ В ТРАНСПОРТИРОВКЕ
ГРУЗОВ
Rab-белки, как правило, встраиваются в везикулу еще на стадии ее формирования за счет связи либо с v-SNARE, либо с элементами окаймления, либо с рецепторами грузов, но ассоциация активированного Rab-белка может происходить и позже, уже после отделения транспортной везикулы от донорной мембраны. Так, например, происходит при формировании АР2-окаймленных пузырьков на плазматической мембране. Rab5, главный регулятор и «распорядитель» всего эндоцитозного пути, встраивается в первичную эндосому уже после снятия клатринового окаймления.
Как бы то ни было, встроенный в везикулу активный Rab реализует еще одну свою функцию, непосредственно связанную с регуляцией транспортных процессов. Эта функция заключается в обеспечении перемещения транспортных везикул к мембране-мишени. О роли цитоскелета в регуляции везикулярного транспорта мы будем говорить отдельно, ибо эта тема достаточно обширна и весьма неоднозначна, тем не менее, как оказалось, если везикулы и используют какие-либо механизмы направленного перемещения, то ключевую роль в них играют именно Rab-белки. Для многих из них выявлены партнеры, которые либо сами являются моторными белками, либо взаимодействуют с ними. Rab-белки могут использовать как моторы, работающие на микротрубочках (динеин, кинезины), так и актиновые моторы (миозины). В некоторых случаях, таких как пигментация кожи, зависящая от определенным образом организованного транспорта везикул, содержащих пигмент меланин, – меланосом, – эта функция может являться основной для клетки, и ее реализует специфический Rab – Rab27a.
5.2. RAB-БЕЛКИ КАК ОРГАНИЗАТОРЫ
МЕМБРАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ
Итак, практически все этапы, от формирования и транспортировки везикулы до специфического слияния с мембраной-мишенью, Rab-белки держат под контролем. Однако, как оказалось, компартменты имеют гораздо более широкий набор Rab-белков, чем количество транспортных путей, в которых они участвуют. Так, на ранних эндосомах, кроме ключевого Rab5, локализуется более десятка различных Rab-белков, причем функции многих из них к настоящему времени неясны. Наиболее характерной чертой распределения Rab-белков на мембране органеллы является то, что различные изоформы не смешиваются, а локализуются в определенных областях мембраны органеллы, или «территориях». Такая мозаичная организация мембраны весьма удобна с точки зрения «распределения обязанностей» – по сути, мембранные территории представляют собой «компартмент в компартменте», упорядочивая участие везикулы или органеллы в нескольких процессах одновременно. Так, Rab5 должен участвовать в процессах гомотипического слияния ранних эндосом, обеспечении их взаимодействия с микротрубочками, а также создания сортирующей платформы, на основе которой будут формироваться поздние или рециклирующие эндосомы. Очевидно, что одна и та же молекула Rab-белка не может попеременно участвовать во всех этих процессах. Действительно, показано, что определенные участки ранней эндосомы несут различные изоформы Rab5 – a, b и с, которые могут еще иметь различный статус фосфорилирования. Кроме того, из ранних эндосом формируются рециклирующие эндосомы, способные отпочковываться как на самых ранних этапах эндоцитоза, так и формироваться позже, уже в околоядерной области. В связи с этим различают короткий и длинный циклы рециклирования, и было показано, что, кроме Rab5, в формировании рециклирующих эндосом короткого цикла участвует еще и Rab4, а длинного ― Rab11. Интересно, что введение в клетку негативных мутантов этих малых ГТФаз приводило не столько к подавлению слияния рециклирующих эндосом с плазматической мембраной, сколько к прекращению их формирования на ранней эндосоме. Этот результат кажется довольно парадоксальным с точки зрения традиционного взгляда на Rab-белки как на регуляторы слияния. Однако, на примере Rab4 прекрасно видно, как они могут поддерживать фактически противоположный слиянию процесс отпочковывания рециклирующих эндосом, путем формирования и поддержания границ мембранных доменов (рис. 28).
 |
а)
б)
в)
Рис. 28. Участие рабаптинов в регуляции слияния мембран и формировании доменной организации эндосом. а) – Рабаптин5
заякоривает две ранние эндосомы за счет взаимодействия
RBD5-доменов с активированными молекулами Rab5;
б) – рабаптин4 устанавливает границу между доменами,
обогащенными Rab5 и Rab4; в) – рабаптин4 участвует
сортировке белков между Rab5- и Rab4-зависимыми
доменами мембраны ранней эндосомы
Одним из эффекторов Rab5 оказался длинный линейный белок рабаптин-5, на обоих концах которого локализованы домены, получившие название RBD (Rab5 binding domain). Его зачислили в группу факторов дистанционного взаимодействия, поскольку, связавшись с активированным Rab5 на одной везикуле, он другим своим концом мог заякориваться на активированном Rab5, сидящем на другой везикуле, и таким образом осуществлять первую стадию слияния.
Однако была, идентифицирована еще одна изоформа рабаптина, работающая на эндосомах и получившая название рабаптин-4, поскольку ее концевые домены узнавали Rab5 и Rab4, локализованные на одной и той же эндосоме. Активация обеих малых ГТФаз вызывала рекутирование рабаптина-4 к эндосоме, а это, в свою очередь, приводило к выстраиванию жестко связанной границы между участком мембраны, занятым Rab5 и соседним участком, «очерченным» Rab4. Хотя точные молекулярные механизмы, определяющие конкретную локализацию определенного Rab-белка, неясны, они очевидно существуют, и возможно, обеспечиваются за счет предпочтительного взаимодействия с теми или иными минорными липидами. В результате формируются участки мембраны, рекрутирующие одни и исключающие другие белки.
Например, трансмембранные белки-рецепторы метаболических лигандов могут вступают на путь рециклирования потому, что их локализация в мембране, «маркированной» Rab4, более выгодна энергетически, а существование «мостиков», формируемых с помощью рабаптина-4, облегчает процесс диффузии таких рецепторов в этот участок мембраны.
Таким образом, Rab-белки участвуют в сортировке белков, формируя сортирующие платформы и обеспечивая доменную (мозаичную) организацию мембран органелл. Учитывая удивительную способность Rab-белков к взаимодействиям с различными клеточными белками, такие платформы дают возможность организовывать множество функционально различных комплексов, в том числе сигнальных, на поверхности одной и той же органеллы. Переходя из «выключенного» состояния во «включенное», ГТФ-связанное, и обратно, Rab-белок работает как таймер, определяя время существования различных комплексов.
6. ЛИПИДЫИ ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ ТРАНСПОРТ
Поскольку по определению везикулярный транспорт – это перенос веществ от компартмента к компартменту с помощью мембранных пузырьков, роль липидов как таковых в этом процессе очевидна. Транспортные процессы (впрочем, как и многие другие) были бы невозможны, если бы клеточные мембраны не могли изменять свою кривизну в определенных местах, реагировать на возникновение локальных напряжений или изменять свой состав тем или иным способом. В течение многих лет в биологии господствовали представления о том, что липидный мембранный бислой фактически представляет собой инертный двумерный растворитель, в котором локализованы различные белки, свободно перемещающиеся в плоскости мембраны. С точки зрения этих представлений именно белки отвечали за все сигнальные и структурные функции. Во многом такие представления были связаны с ограниченной возможностью определения состава мембран как компартментов, так и их субдоменов или мелких везикул. Действительно, хотя биологические мембраны животных содержат три основные классы липидов: фосфоглицеролипиды, сфинголипиды и холестерин (у растений и дрожжей его роль выполняет другой стерол – эргостерин), ― большое количество модификаций головных групп, по-разному гликозилированных, и различия в длине хвостов и степени их насыщенности приводят к чрезвычайному разнообразию минорных компонентов. К настоящему времени идентифицировано более сотни мембранных липидов, притом, что наиболее распространенными являются лишь несколько. Так, к фосфоглицеролипидам относятся фосфатидилэтаномамин (PE), фосфатидилхолин (PC), фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилинозитол (PtdIns). Основными представителями семейства сфинголипидов являются сфингомиелин (SM) и гликозил-, галактозил- и лактозилцерамиды (GlcCer, GalCer и LacCer, соответственно).
Кроме того, развитие методов флуоресцентной микроскопии, таких как FRET и FRAP, получение флуоресцирующих аналогов липидов, сделало возможным тонкий анализ их распределения в мембране. Стало понятно, что это распределение ассиметрично (см. далее), и кроме того, часто коррелирует с распределением определенных белков. Можно с уверенностью утверждать, что липиды не являются инертной платформой, а действуют совместно с белками как единый ансамбль.
Белки могут взаимодействовать с мембраной разными способами. Так, белки, имеющие последовательности из гидрофобных аминокислот, могут заякориваться в мембране с помощью этих участков. В зависимости от локализации такого участка в концевом или внутреннем домене белка белок будет периферическим или трансмембранным. Длина гидрофобного участка определит, среди каких липидов (с длинными или короткими хвостами) белку энергетически более выгодно находиться. Таким образом, стремление к соответствию толщины мембраны и длины гидрофобного участка белка во многих случаях работает как механизм сегрегации в определенный участок мембраны одних белков или липидов и исключения других. Кроме того, белок может ассоциироваться с мембраной за счет наличия в своем составе остатков пальмитиновой и миристиновой жирных кислот (из уже рассмотренных примеров миристилированы малые ГТФазы Arf-семейства), или фарнезилированных или геранил-геранилированных изопреноидов (Так, например, белки Ras-семейства фарнезилированы, а малые ГТФазы Rab содержат геранил-геранильный хвост). Некоторые белки могут быть модифицированы остатком холестерина. Свойства гидрофобных «якорей» этих типов позволяют модифицированным ими белкам покидать мембрану и вновь ассоциироваться с ней.
Особый класс составляют белки, ковалентно пришитые к липиду гликозилфосфатидилинозитолу (GPI-anchored proteins). Они не имеют ни трансмембранного домена, ни цитоплазматического хвоста, и уже в ЭПР упаковываются в везикулы таким образом, что оказываются изолированными от цитоплазмы, и лишь после экзоцитоза становятся компонентами внешнего, экстраклеточного слоя плазматической мембраны. Функции GPI-заякоренных белков разнообразны – среди них есть ферменты, молекулы адгезии, маркеры дифференцировки и др. Существуют и иные способы ассоциации белков с мембранными липидами.
6.1. «ТРАНСМЕМБРАННАЯ» АССИМЕТРИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ
Как известно, биологические мембраны состоят из двух слоев, обращенных друг к другу гидрофобными сторонами. Хотя синтез большинства липидов de novo происходит в цитоплазматическом слое мембраны ЭПР, их распределение между внутренним и внешним слоями оказывается одинаковым. Это означает, что вновь синтезированные липиды способны перераспределяться из одного слоя мембраны ЭПР в другой. С другой стороны, состав внешнего и внутреннего слоев плазматической мембраны существенно различаются: первый обогащен сфингомиелином и гликолипидами, тогда как цитоплазматический слой содержит PE, PS и фосфоинозитиды. Трансмембранная ассиметрия весьма существенна для нормального функционирования клеток. Например, появление фосфатидилсерина на наружном слое клеточной мембраны в результате потери асимметричности служит для фагоцитарных клеток организма индикатором апоптозных клеток. В этом случае фосфатидилсерин распознается рецепторами макрофагов, что приводит к поглощению таких клеток.
Очевидно, что существуют механизмы создания и поддержания трансмембранной ассиметрии. Это, во-первых, спонтанная диффузия, не требующая белковых «носителей» и энергетических затрат. Во-вторых, липиды могут перескакивать из слоя в слой с помощью белков, получивших название флиппаз (от англ. flip, «переворачивать, зеркально отражать»), работающих в двух направлениях. Флиппазы могут быть как АТФ-независимыми, так и АТФ-зависимыми. Так, АТФ-независимая флиппаза эндоплазматического ретикулума равномерное распределение липидов в обоих слоях мембраны при их клеточном синтезе. АТФ-зависимые флиппазы переносят фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин с внешнего (в случае плазматической мембраны) и внутреннего (в случае внутриклеточных органелл) слоя мембраны на цитозольный слой мембраны. Перенос фосфолипидов в обратном направлении осуществляется АТФ-зависимыми флоппазами (от англ. flop, «перебрасывать»). Флоппазная реакция – более медленная и менее специфичная по отношению к фосфолипиду, ее поддерживают так называемые ABC- транспортеры (ATP-binding cassette (ABC) transporters).
И наконец, существуют предположения, что наиболее специфическим однонаправленным перераспределением (в основном, аминофосфолипидов) занимаются транслоказы, работающие за счет гидролиза АТФ.
Кроме того, стабилизация состава двух слоев мембран обеспечивается за счет взаимодействия с цитоскелетом с цитоплазматической стороны, и (в случае плазматической мембраны) взаимодействием липидов с внеклеточным матриксом с внешней.
Казалось бы, перенос гидрофобных липидов от компартмента к компартменту возможен только в составе мембраны, т. е. с помощью везикулярного транспорта. Однако в клетках млекопитающих было идентифицировано целое семейство белков, получивших название PITP (от англ. p hosphatidyl i nositol t ransfer p roteins). Эти белки способны экстрагировать фосфатидилинозитол из мембраны, в которой его много (это мембрана ЭПР, где PI синтезируется) и вставлять в мембрану, где его мало, обменивая PI на PC. Белки семейства PITP играют существенную роль в сигнализации через фосфолипазу С и фосфатидилинозитол-3-киназы, а также участвуют в регуляции различных аспектов везикулярного транспорта, от биогенеза везикул до регулируемого экзоцитоза.
6.2. ЛАТЕРАЛЬНАЯ АССИМЕТРИЯ
РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ
В зависимости от свойств гидрофобных хвостов возможна более или менее тесная упаковка молекул липидов в слое, результатом которой будет разделение на «фазы» в плоскости мембраны: так называемую «жесткую», или гелевую, и «жидкую», которая в свою очередь делится на упорядоченную и неупорядоченную Холестерин при этом разжижает жесткую и упорядочивает жидкую фазы (рис. 29)
Рис. 29. Разделение мембраны на «фазы» в зависимости
от свойств липидных молекул
Уже одно это свойство предполагает, что в плоскости мембраны могут существовать домены определенного состава. Кроме того, синтез разных липидов, начинаясь в мембранах ЭПР, продолжается в мембранах аппарата Гольджи, тем самым обеспечивая уникальный липидный состав этих органелл. Уже упоминавшиеся современные методы анализа и детекции липидов показали, что все мембраны без исключения построены по доменному принципу, иными словами, существует латеральная ассиметрия их распределения.
С «клеточной» точки зрения домены могут быть огромными (размером в микроны), примером таких доменов могут служить мембраны компартментов клеток животных: если ЭПР содержит 60 % PC, 10 % PE и 10 % PI, то плазматическая мембрана состоит на 25 % из PC, на 10 % SL и на – 5% PS. Кроме того, она содержит 30–40 % холестерина.
Домены могут быть также маленькими (так называемые микродомены диаметром 10–100 нм), содержащими от нескольких десятков до нескольких тысяч липидных молекул. Наиболее известными (но не единственными) представителями микродоменов являются, так называемые рафты. Они получили свое название от английского слова raft, или плот, поскольку имеют свойство перемещаться в плоскости мембраны как единое целое. Метод их выделения отразился в других вариантах названий – DIGs или DRM, что означает d etergent- i nsoluble g licosphingolipid-enriched membranes в первом случае и d etergent- r esistant m embranes – во втором. Действительно, впервые они были выделены как осадок после ультрацентрифугирования клеток, обработанных 0,1 %-ным Тритоном Х-100 в течение 30 мин при 4 оС. Впоследствии оказалось, что существуют рафты с различной чувствительностью к детергентам. Так, некоторые рафты растворяются в Тритоне Х-100, но сохраняются в более мягких детергентах, типа Brij98 или Tween.
Рафты способны включать одни липиды и исключать другие. Характерным свойством рафтов считается их обогащенность гликосфинголипидами, сфингомиелином и в особенности холестерином, а также способность специфически ассоциироваться с определенными белками. Так, рафты обогащены GPI-заякоренными белками. Кроме того, рафты аккумулируют сигнальные белки и тем самым очень важны для внутриклеточной сигнализации. Липидная композиция рафта благодаря наличию минорных компонентов, может определять набор белков, включаемых в данный рафт, и таким образом способствовать специфичности клеточных реакций. Единичный рафт размером около 50 нм содержит 3500 молекул сфинголипидов и 10–30 белковых молекул. Как правило, один рафт не может свести воедино все белки, участвующие в сигналинге, поэтому образуются кластеры рафтов.
Поскольку холестерин по сравнению с другими липидами легко переходит из слоя в слой, изменяя их размеры и геометрию, то места искривления мембран часто связаны именно с рафтами. Два наиболее известных типа рафтов – кавеолиновые и промининовые, как раз характеризуются высокой степенью кривизны. Кавеолы представляют собой флаконообразные инвагинации плазматической мембраны, основные компоненты которых – белок кавеолин и липид холестерин. Промининовые рафты, напротив, формируют выпячивания плазматической мембраны – микроворсинки и протрузии, и ключевыми их компонентами являются все тот же холестерин и белок проминин. В области рафта происходят и инвагинации мембраны, приводящие к формированию эндоцитозных пузырьков. Если экспериментально истощать мембрану по холестерину, инкубируя клетки с его нефункциональным аналогом, то самыми первыми исчезают кавеолы, затем блокируется пиноцитоз, и только при высоких концентрациях заместителя подавляется клатрин-зависимый эндоцитоз. Этот пример еще раз подчеркивает важность взаимодействия белков и липидов.
Рафтами обогащены плазматическая мембрана и эндосомы, особенно рециклирующие. Наличие таких доменов может приводить к различной динамике мембранных доменов и определять судьбу ассоциированных с ними белков. Так, GPI-связанные белки в норме рециклируют через один и тот же околоядерный рециклирующий компартмент, что и рецепторы трансферрина, но в 3 раза медленнее. Однако если истощить клетки по холестерину, то скорость рециклирования двух этих белков будет одинакова.
Кроме рафтов, на эндоцитозном пути также можно выделить еще несколько «липидных территорий». Так, как уже упоминалось выше, сайты инициации формирования окаймленных клатрином ямок обогащены фосфатидилинозитол-4,5-бифосфатом, PI (4,5)P2. Одним из белков, рекрутируемых на ранние эндосомы после активации Rab5, является фосфатидилинозитол-3-киназа Vps34, фосфорилирующая PtdIns с получением монофосфата PI(3)P, который играет ключевую роль в формировании сортирующей платформы на мембране эндосомы, куда секвестируются (отбираются) все белки, направляемые на деградацию в лизосомы. Интересно, что этот монофосфат – единственный из фосфопроизводных фосфоинозитидов, который деградирует только в лизосомах, и в конечном итоге является основой мембран внутренних пузырьков МВЭ. Благодаря его способности формировать эти внутренние пузырьки белки, сопряженные с PI(3)P, также оказываются внутри поздних эндосом и после слияния с лизосомами подвергаются деградации.
Поздние эндосомы вообще богаты специфическими липидами. Так, продукт повторного фосфорилирования PI(3)P, PI(3,5)P2, участвует в формировании везикул, рециклирующих из эндосом на поздних стадиях эндоцитоза. Внутренние пузырьки МВЭ состоят, по крайней мере, из двух различных популяций – PI(3)P-обогащенных (и содержащих эндоцитированный материал), и обогащенных лизобифосфатидной кислотой (LBPA). LBPA несет дополнительный остаток фосфатидной кислоты, и в отличие от довольно распространенной лизофосфатидной кислоты (LPA), его доля в тотальном пуле клеточных липидов меньше 1 %, тогда как во внутренних пузырьках МВЭ LBPA составляет около 15 %. Платформы на основе этого липида, не подвергаясь сами деградации, по всей видимости, доставляют внутрь МВЭ вновь синтезированные лизосомные ферменты (т. е. инструмент для деградации макромолекул в эндолизосомах) и отвечают за возврат соответствующей транспортной машинерии в АГ, поскольку истощение клеток по LBPA блокирует возвратный транспорт в транс-Гольджи из поздних эндосом.
6.3. ЛИПИДЫИ ФОРМООБРАЗОВАНИЕ
Как упоминалось в вводных главах, клетки животных содержат органеллы, все разнообразие которых можно свести к нескольким типичным формам: везикулярной (с широким диапазоном диаметров), тубулярной (с превышением длины над диаметром), и смешанной тубуло-везикулярной.
Различные липидные (а соответственно, и белковые) домены, как правило, связаны с определенной формой или размером (определяющимся кривизной мембраны) органеллы. Вопрос о механизмах формирования таких зон, очевидно, весьма важен для понимания функционирования клеточных компартментов. Основные представления в этой области получены с использованием двух подходов: (1) анализа формирования больших искусственных бислойных везикул (LUVs) из смеси различных липидов и (2) исследования поведения аналогов биологических липидов, обычно флуоресцентно-меченых, при введении их в мембраны клеток. Таким образом, первый подход дает сведения о том, как свойства липидов влияют на формообразование, тогда как второй позволяет понять роль уже существующих органелл определенной формы в локализации липидов.
Оказалось, что при формировании LUVs из сфингомиелина (SM), холестерина и фосфатилилхолина (PC) происходило формирование тубуло-везикулярных структур с преимущественной локализацией насыщенного жестко-организованного SM в везикулярной части, и ненасыщенного PC в тубулярной, обладающей большей кривизной, части везикулы. Интересно, что относительно компактный небольшой холестерин предпочитал также везикулярный домен LUVs. Таким образом, локализация липидов в этих искусственных модельных образованиях соответствовала наблюдаемым в живых клетках локализации SM и холестерина на плазматической мембране и РС – во внутренних мембранах с высокой кривизной.
Эксперименты с флуоресцентными аналогами липидов с различной «жесткостью» хвостов (Dil-C16(3) имеет насыщенный хвост, а FAST Dil отличается от него тем, что несет дополнительные ненасыщенные алкильные цепи, делающие его «жидким») также показали, что при добавлении новых молекул к плазматической мембране, они оба относительно медленно попадают в мембраны ранних эндосом, но затем подвергаются сортировке: если Dil-C16(3) направляется во внешнюю мембрану МВЭ, то FAST-Dil предпочитает рециклирующие эндосомы.
Можно предполагать, что сортировка в данном случае идет по принципу «подобное к подобному». Таким образом, наиболее энергетически выгодная упаковка разных липидов может приводить к формированию наблюдаемых в клетке мембранных доменов определенной структуры.
Кроме того, в определении формы мембраны играет роль такой простой фактор, как геометрическая форма самого липида. Все разнообразие липидных молекул, состоящих из полярной головы и жирнокислотного хвоста, укладывается в три геометрические формы: конус (маленькая голова, хвост большего диаметра), инвертированный конус (голова большого размера по сравнению с диаметром хвоста) и цилиндр (в этом случае размеры головы и хвоста приблизительно равны). Если бы монослой мог образоваться только из липидов какой-то одной группы, и, учитывая гидрофильность внутриклеточной среды, из молекул первого типа будут формироваться инвагинации, направленные из цитоплазмы, второй тип даст противоположное искривление (соответствующее формированию транспортных везикул), а третий тип будет организовывать максимально плоские мембраны.
Очевидно, что в бислое с определенным соотношением липидов разных форм перераспределение липидов из одного слоя в другой с помощью упоминавшихся выше механизмов, либо модификация липидов соответствующими ферментами, приводящая к изменению их геометрической формы, будут приводить к появлению участков с измененной кривизной.
На форму мембран влияют и белки, и белковые структуры, например, цитоскелет. Длинные полимеры цитоскелета способны взаимодействовать с липидами как пассивно, через цитоскелет-связанные белки, так и активно, через моторые белки. В обоих случаях будет наблюдаться тубуляция, развивающаяся с разной скоростью. Так, в норме тубулярная сеть ЭПР опирается на микротрубочки, оставаясь способной «скользить» по ним при их искривлении. Различные микроворсинки, как правило, формируются за счет полимеризации актина в примембранной области и результирующего выпячивания мембраны, направление которого определяет взаимодействие мотора миозина с мембраной и микрофиламентами. Роль динамина и белков окаймления в искривлении мембран обсуждалась выше.
В конечном итоге, форму мембраны или ее изменение определяют совместно как липиды, так и белки, хотя вклад каждого компонента может быть различным.
6.4. ФОСФАТИДИЛИНОЗИТИДЫКАК
РЕГУЛЯТОРЫТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ
Фосфатидилинозитиды (PtdIns) играют важную роль в регуляции как сигнальных, так и транспортных процессов в клетке, однако в рамках настоящего пособия мы остановимся только на последних, хотя часто трудно разделить оба процесса.
Фосфатидилинозитиды представляют собой комбинацию гидрофобного хвоста, представленного фосфатидной кислотой с различными модификациями, и поляр