Схема
Характер и интенсивность жизнедеятельности почвенной микрофлоры в значительной степени обусловлены физико-химическим составом и поглотительной способностью почвы. Под поглотительной способностью почвы понимают способность задерживать находящиеся в растворенном состоянии соединения или части их, а также частички минерального и органического вещества в коллоидном состоянии, микроорганизмы и грубые суспензии. Различают различные виды поглотительной способности: механическая – связана с пористостью почвы; физическая – связана с явлениями поверхностного натяжения; биологическая – связана с поглощением из почвенного раствора веществ микроорганизмами или растениями и т.п.
В составе микрофлоры почвы выделяют следующие группы микроорганизмов:
- бактерии аммонификаторы, вызывающие гниение (аммонификация белковых веществ) трупов животных, остатков растений, разложение мочевины с образованием аммиака и других продуктов: наибольшее значение в аэробном разложении белка имеют споровые бактерии – Bac.mycoides, Bac.subtilis, Bac.mesentericus, Bac.megaterium и др.; аэробные бесспоровые бактерии – Bact.prodigiosum; факультативно-анаэробные бактерии, в особенности рода Proteus; грибы рода Aspergillus, Mucor, Penicillium; некоторые актиномицеты; анаэробы - Cl.sporogenes, Cl.putrificum; аммонификация мочевины осуществляется так называемыми уробактериями – Bac.probatus, Urobac.pasteurii, Urobac.leubii, Urobac.miqueli, Sarcina ureae, Micrococcus ureae и др.;
- нитрифицирующие бактерии: Nitrobacter и Nitrosomonas (Nitrosomonas окисляют аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты, Nitrobacter превращают азотистую кислоту в азотную и нитраты);
- азотфиксирующие бактерии: усваивают из воздуха свободный кислород и в процессе своей жизнедеятельности из молекулярного азота синтезируют белки и другие органические соединения азота, используемые растениями;
- бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов - серобактерии, железобактерии и т.д. (серобактерии окисляют сероводород до серной кислоты, железобактерии окисляют соединения железа до гидрата окиси железа, фосфорные бактерии способствуют образованию легко растворимых соединений фосфора);
- бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие брожение (молочнокислые, спиртовые, маслянокислые, уксусные, пропионовые и др.).
Помимо многочисленных микроорганизмов являющихся естественными обитателями почвы, то есть свободно живущими в ней в почву попадает огромное количество представителей нормальной и патогенной микрофлоры человека и животных. Патогенные микроорганизмы и представители нормальной микрофлоры попадают в почву с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной и другими выделениями, с трупами людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Патогенные микробы и представители нормальной микрофлоры тела человека и животных, попадая в почву, рано или поздно погибают или изменяются. Некоторые из них адаптируясь, остаются постоянными ее обитателями. Большинство патогенных микроорганизмов сохраняются в почве относительно недолго, длительно сохраняются споровые бактерии. Патогенные почвенные бактерии условно разделены:
- микроорганизмы, постоянно обитающие в почве – возбудители ботулизма, газовой гангрены, столбняка – попадая с испражнениями человека и животных, их споры сохраняются неопределенно долго;
- микроорганизмы, для которых почва вторичный резервуар – возбудители сибирской язвы – попадая в почву с фекалиями человека и животных, с прочими отправлениями, трупами погибших животных, при благоприятных условиях могут размножаться и длительное время сохраняться в виде спор;
- микроорганизмы, сохраняющиеся от нескольких часов до нескольких недель или месяцев – возбудители брюшного тифа, дизентерии, холеры, чумы и многие другие – различные споронеобразующие микробы, попадающие с выделениями человека и животных, гибель которых является следствием неспособности образовывать споры, отсутствия влаги, подходящих питательных субстратов, неблагоприятных условий температуры и т.п.
Санитарно-бактериологические показатели почвы и их нормирование.
Санитарное состояние почвы - совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении.
Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые:
1) Косвенные характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это - санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и, как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм Cl.perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.
2) Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы - обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).
Результаты анализов оцениваются в соответствии с таблицей.
Таблица. Оценка степени эпидемической опасности почвы
| Категория загрязненности почв | Индекс БГКП | Индекс энтерококков | Патогенные бактерии, в т.ч. сальмонеллы | Яйца гельминтов, экз./кг | Личинки-Л и куколки-К мух, экз. в почве с площадью 20х20 см |
| Чистая | 1-10 | 1-10 | |||
| Умеренно опасная | 10-100 | 10-100 | до 10 | Л-до 10 К-отсутствие | |
| Опасная | 100-1000 | 100-1000 | до 100 | Л-до100, К-до10 | |
| Чрезвычайно опасная | 1000 и выше | 1000 и выше | > 100 | Л > 100, К > 10 |
Почву оценивают как «чистую» без ограничений по санитарно-бактериологическим показателям при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.
О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и энтерококков 10 и более клеток/г почвы.
При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности ее к самоочищению исследуются показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы и актиномицеты, аммонификаторы, аэробные целлюлозные микроорганизмы и т.д.
Перечень показателей определяется целями исследования, природой и интенсивностью загрязнения, характером землепользования.
Определение общих колиформных бактерий (БГКП)
Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) давно уже считаются удобными микробными индикаторами. Показатель «бактерии группы кишечных палочек» (БГКП) приведен в соответствие с принятой международной номенклатурой, который идентичен показателю «общие колиформные бактерии». К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при 35-37°C с образованием кислоты, газа и альдегида, то есть на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24 - 48 ч. Они оксидазоотрицательные и не образуют спор. Бактерии группы кишечной палочки включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации.
При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение титрационным методом. В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведения суспензии на поверхность среды Эндо.
Для исследования используют предварительно подготовленные почвенные суспензии и разведения по описанной выше методике.
Титрационный метод определения индекса БГКП (колиформ) в почве
Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 см3, засевают во флаконы с 90,0 см3 жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) или среды Кесслера, что соответствует засеву 1 г почвы. Соотношение между навеской почвы или ее эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации - 1:1. Посев меньших количеств (0,01 г, 0,001 г, то есть 10, 10 и т.д.) делают по 1,0 см3 из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9,0 см3 тех же сред. Титрование проводят до разведения 1:1000000, то есть 10 с регулярной сменой пипеток при переходе от одного разведения к другому. Посевы инкубируют в течение 48 ч при 37±1°C, через 24±2 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов: при отсутствие газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают окончательный отрицательный ответ, при наличие газообразования или только помутнения - производится высев на поверхность среды Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат на 18-24 ч при температуре 37±1°C. При отсутствии роста на чашках выдают отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний, малиновых с металлическим блеском или без него проводят микроскопию колоний с последующей постановкой оксидазного теста. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий рода Pseudomonoas и других видов сапрофитных бактерий. При наличии оксидазоотрицательных грамотрицательных палочек по 2 – 3 колонии каждого типа засевают параллельно в 2 пробирки в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой, разлитую в пробирки в количестве 4,0 - 5,0 см3, для подтверждения ферментации лактозы при температуре 37±1°C. Учет производят через 18 ч инкубации. Если за это время происходит образование кислоты и газа, это свидетельствует о наличии бактерий группы кишечных палочек. Признаком газообразования является появление пузырьков газа, об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При появлении только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного ответа еще на 24 ч, при отсутствии газообразования через этот срок выдают окончательный отрицательный ответ, при появлении газообразования - положительный ответ. После выявления БГКП устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы. Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.
Определение БГКП в почве методом мембранной фильтрации
В качестве ускоренного метода для обнаружения колиформных бактерий целесообразно использовать метод мембранных фильтров.
Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Метод основан на фильтрации установленного объема - 5,0 - 10,0 см3 почвенной суспензии первого разведения (1:10) - через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной, питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Для того чтобы облегчить фильтрование почвенной суспензии через мембранный фильтр, желательно до фильтрования провести предварительную обработку. Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.
Подготовка фильтровального аппарата
Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.
Следует начинать с фильтрования проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты, разлитую в стерильные чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Эта среда используется только при работе методом мембранной фильтрации. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37±1°C в течение 24±2 ч. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие БГКП в исследуемой почве. Анализ заканчивают через 24 ч. Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к БГКП.
Для подтверждения наличия БГКП исследуют:
- все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
не менее 3 - 4 колоний каждого типа.
Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:
- наличие оксидазной активности;
- принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);
- ферментацию лактозы до кислоты и газа.
Для расчета индекса количества бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме почвы, умножают на 1000 и делят на этот объем.
Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета БГКП в почве
При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 см3 на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведении от 1:10 до 1:1000. При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10. Посевы выращивают в термостате при 37±1°C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.
Определение энтерококков
Энтерококки - грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными кокками. Полиморфны. При росте на жидких средах (ЛПС - лактозо-пептонная среда, ЩЭС - щелочно-полимиксиновая среда) вызывают диффузное помутнение и образование осадка. Подготовка проб и приготовление разведений указаны выше.
Титрационный метод
Из разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 см3 и засевают во флаконы с 50 см3 жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют при температуре 37±0,5°C 24 ч. Из порции среды накопления, где отмечены признаки роста, производят высев петлей на одну из плотных сред (МИС - молочно-ингибиторная среда, ЖСТ - желточная среда Турчинского). Если через 24 ч признаки роста отсутствуют, посевы оставляют еще на сутки. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ. Через 24 - 48 ч инкубации посевов на молочно-ингибиторной среде при температуре 37±0,5°C в качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний. Эта среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: Е.faecalis образует аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском, Е. faecalis биовар liguefaciens - такие же колонии, окруженные зоной просветления, Е.faecium биовар durans - серые, мелкие, плоские колонии. Для подтверждения наличия энтерококков делают микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест. После выявления энтерококков устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы. Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.
Метод мембранных фильтров
Объем испытуемой пробы для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50. Через мембранные фильтры профильтровывают 2 - 3 десятикратных объема испытуемой пробы. Фильтры с посевом помещают на азидную среду или среду ЖСТ и инкубируют при температуре 37±0,5°C в течение 24 - 48 часов.
Учет результатов на среде ЖСТ. Учет результатов на среде ЖСТ производят через 24 - 28 часов. Для учета выбирают фильтры, на которых выросло не более 20 - 30 колоний. Подсчитывают характерные для энтерококков колонии: плоские крупные с ровными краями, белые или бледноокрашенные с небольшим кремовым или розовым оттенком, а также малиновые. Последние образованы E. faecalis. Если выросли колонии другого вида - выпуклые белые мелкие или ярко окрашенные, то их принадлежность к энтерококкам можно подтвердить по отсутствию каталазной активности и по характерной морфологии клеток при микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Каталазный тест можно выполнить путем нанесения петлей капли 3%-ной перекиси водорода на подозрительные колонии. Более точно каталазный тест выполняют на предметном стекле, нанося петлей культуру и после подсушивания на воздухе добавляя каплю свежеприготовленной 3%-ной перекиси водорода и прикрывая покровным стеклом. Наличие пузырьков газа - положительный тест.
Учет результатов на азидной среде. Для учета выбирают фильтры, на которых выросло от 5 до 50 колоний. Подсчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые, с ровными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным нечетко оформленным центром. Как правило, все колонии, которые растут на азидной среде, можно отнести к фекальным энтерококкам, имеющим индикаторное значение. Очень мелкие (на пределе видимости невооруженным глазом), плоские разных оттенков колонии не учитывают. При необходимости подтвердить наличие энтерококков по 2 – 3 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по Граму. При обнаружении в мазках грамположительных полиморфных диплококков дают положительный ответ. Вычисление индекса энтерококков: подсчитанное число колоний энтерококков суммируют и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет. Для расчета индекса количество колоний энтерококков суммируют, умножают на 1000 и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.
Определение Cl.perfringens в почве
Сульфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре 44±1°С в течение 16 - 18) ч.
Принцип метода
Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.
Посев почвенных разведений в среде Вильсон-Блера. Из приготовленных почвенных разведений (до 1:10), прогретых при температуре 75±5°C в течение 20 минут для исключения вегетативных форм, по 1,0 см3 переносится в два параллельных ряда пробирок. Затем во все пробирки наливают по 9 - 10 см3 горячего железосульфитного агара, приготовленного ex tempore и прогретого до 70 - 80°C (среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков). Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при 44±1°C в течение 16 - 18 часов. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ о присутствии Сl.perfringens в 1 г почвы.
Определение методом фильтрования в пробирках. Перед посевом пробирки с железосульфитным агаром расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до 70 - 80°C в водяной бане. После фильтрования установленного объема мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки. Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при 44±1°C в течение (16 - 18) ч.
Определение методом фильтрования в чашках Петри. Чашки Петри заливают тонким слоем железосульфитного агара 4,0 - 5,0 см3. После фильтрации фильтр помещают фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при 44±1°C в течение (16 - 18) ч. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. При отсутствии роста на всех фильтрах – дают отрицательный ответ.
Показатели биологической активности почвы
Основными интегральными показателями биологической активности являются: общая микробная численность (ОМЧ), определение актиномицетов, аммонификаторов, нитрификатов и др.
Определение количества актиномицетов и грибов в почве
Актиномицеты (греч. Actis - луч, mucos - гриб) – одноклеточные микроорганизмы, тело которых состоит из несептированного мицелия, который имеет вид ветвящихся тонких нитей. У актиномицетов, как и у бактерий, генетическую функцию выполняет нуклеоид. В нитях мицелия находятся зерна хроматина. Размножаются актиномицеты при помощи специальных органов плодоношения, путем прорастания спор, прикрепленных на спороносцах, простым делением, перешнурованием и почкованием. Актиномицеты - факультативные анаэробы, хорошо развиваются при t = 25-30°C (оптимальная температура 35-37°C) на плотных средах. Одни виды растут с образованием плотных гладких колоний, другие имеют складчатые, бугристые, корковидные, бархатистые, пушистые или мучнистые колонии, которые срастаются со средой и с трудом снимаются петлей. Колонии актиномицетов могут быть бесцветными или пигментированными (синие, фиолетовые, красные, желтые, оранжевые, зеленые и т.д.), на плотных питательных средах часто образуют воздушный мицелий, на концах которого развиваются споры, придающие колониям определенный цвет.
Грибы. Среди грибов встречаются сапрофиты и паразиты.
Наибольшее значение для медицины представляют оомицеты (Oomycetus), аскомицеты (Ascomycetes), базидиомицеты (Basidiomycetes), дейтеромицеты (Deuteromycetes), форма клеток у молодых культур может быть круглая, яйцевидная или удлиненная, у зрелых клеток - грушевидная, булавовидная, веретенообразная, амебовидная. Основным структурным компонентом клеток грибов является мицелий, состоящий из разветвленных бесцветных нитей (гиф). У одних видов он состоит из нерасчлененной клетки (Mucor), у других (высших грибов) он многоклеточный; у дрожжеподобных грибов (Candida) имеется псевдомицелий.
Установлена большая чувствительность почвенных актиномицетов и грибов к действию отдельных химических веществ по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Несомненно, что такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ. Благодаря чрезвычайно выраженным антагонистическим и токсическим свойствам они оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных биоценозов, являются продуцентами многих физиологических активных веществ: аминокислот, ферментов, витаминов.
Для учета почвенных актиномицетов и грибов используются те же разведения почвенной суспензии, что и при учете общей численности микроорганизмов. Как правило, для учета почвенных грибов используют разведение почвенной суспензии 1:10 - 1:100, то есть 10 - 10, а при учете актиномицетов - 1:100 - 1:10000 (от 10 до 10). Посев производят поверхностным способом, нанося на агаризованные среды 0,1 - 0,05 см3 суспензии. Для учета актиномицетов используется чаще всего крахмало-аммиачный агар или агар Ваксмана, при учете грибов - сусло-агар или минеральная среда Чапека. При учете грибов используют добавление в среду веществ, ингибирующих рост бактерий, - концентрированную молочную кислоту в количестве 4 мл/л среды. Прибавлением такого количества кислоты доводят рН среды до 4,0 - 4,5. Кислота добавляется непосредственно перед посевом в расплавленную среду. Поскольку прибавляют концентрированные кислоты, то их предварительно не стерилизуют.
Определение аммонификаторов в почве
Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на мясо-пептонном агаре, а при необходимости на жидких пептонных средах (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными бумажками, определяющими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака краснеют). При выращивании почвенных суспензий на мясо-пептонном агаре результаты выражают в КОЕ (колониеобразующих единицах) на 1 г почвы. При определении этого показателя в жидких средах определяют титр, индекс аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25 - 30°C.
Определение токсичности почв по отношению к микроорганизмам
Метод определения степени токсичности почв к микроорганизмам используется в качестве быстрого и достаточно чувствительного теста для получения ориентировочных данных о способности почвы самоочищаться от патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Кроме того, этот тест оказался также чувствительным при определении влияния химических веществ на почвенный микробиоценоз. Низкая степень токсичности или ее снижение по отношению к патогенным микроорганизмам свидетельствует о наличии или возникновении более благоприятных условий для выживания возбудителей в таких почвах. Это явление неблагоприятное по классам:
1 - отсутствие - 0 - 20% токсичных образцов,
2 - слабо выраженная - 21 - 40% токсичных образцов,
3 - средняя - 41 - 60% токсичных образцов,
4 - сильно выраженная - 61 - 80% токсичных образцов,
5 - абсолютная - 81 - 100% токсичных образцов.
Для определения токсичности почв можно использовать два метода - качественный и качественно-количественный.
Качественный метод определения токсичности почв
В стерильную чашку Петри вносится 10 г перемешанной и просеянной почвы и ровным слоем распределяется на половину дна чашки. На дне и крышке чашки записывается номер пробы по журналу и тест-микроорганизм. Затем чашки переносят в бокс и устанавливают на ровной поверхности. Чашки с почвой заливают 1,5%-ным непитательным агаром в количестве около 10,0 см3 с таким расчетом, чтобы он покрыл слой почвы. После его застывания в чашки вносится питательный агар также в количестве 10 см3, адекватный тест- микроорганизмам. Из одного почвенного образца готовятся 2 параллельные чашки к каждому микроорганизму. Чашки высушивают под бактерицидными лампами в течение 30 минут. Затем производится посев индикаторных штаммов микроорганизмов.
Посевы производятся петлей, причем движения петли всегда начинают с той части чашки, на которой помещена почва. В качестве контроля производят посевы тех же культур на аналогичные среды, но без почвы.
Посевы инкубируют в зависимости от вида индикаторного микроорганизма. Учет результатов начинается с просмотра контрольного посева. В случае равномерного роста тест-микроба на всей поверхности агаровой пластинки просматривают остальные чашки с посевами. Колонии идентифицируются по «форме роста». Кроме того, из каждой серии посевов с нескольких чашек снимают колонии и производят их идентификацию.
Рост колоний только на участке агаровой пластинки, под которой нет почвы, показывает, что исследованный почвенный образец токсичен (Т). При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловыраженная токсичность (М/Т).
Качественно-количественный метод определения токсичности почв
В стерильную чашку Петри также вносится 10 г почвы и распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится непитательный и питательный агар. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.
На матовую поверхность мембранных фильтров простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуют кипячением. Затем на питательную среду помещают мембранные фильтры (матовой поверхностью вверх) в количестве от 1 до 4-х на одну чашку. На поверхность фильтра в местах, отмеченных точками, производят посев бактериальной петлей (иглой) культуры индикаторного штамма, суспензированного в физиологическом растворе, содержащем около 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Эта манипуляция упрощается при использовании специального штампа в виде металлического диска диаметром около 30 мм. В диск вмонтированы 16 стальных игл строго одинаковой длины и толщины. Культуры микроорганизмов наливают в чашки Петри и погружают в них кончики игл стерильного штампа, а затем одновременно производится посев в 16 точках мембранного фильтра. Посевы инкубируют в термостате или анаэростате при оптимальной температуре и продолжительности в зависимости от физиологических особенностей индикаторного штамма.
Учет результатов производят путем подсчета выросших колоний в точках посева. Процент пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле: Т = 100 - Р. Этим методом, как и качественным, устанавливается абсолютная токсичность, когда на фильтрах не вырастает ни одна колония; отсутствие токсичности - на метах всех посевов вырастают колонии и различная степень токсичности - когда прорастает только часть засеянных точек.
Определение патогенных энтеробактерий родов Salmonella и Shigella в 1 г почвы
Сущность определения шигелл и сальмонелл заключается в использовании методов накопления патогенных бактерий в средах обогащения с последующим пересевом на плотные селективные и дифференциальные среды с последующим изучением биохимических свойств выделенных культур и их серологическую идентификацию по методике.
Используют не менее двух сред накопления из перечисленных: среду Мюллера Кауфмана, селенитовый бульон, магниевую среду, тетратионатовый бульон. Для сальмонелл используют любые две среды из четырех, для шигелл - селенитовую среду.
Проведение исследования аналогично исследованию на колиформы Посевы инкубируют при 37±1°C в течение 18 - 24 часов, затем из каждого флакона делают высевы бактериологической петлей на чашки с плотными селективными средами: для сальмонелл – на висмут-сульфитный агар, ксилозо-лизин-дезоксихалатный агар, для шигелл на бактоагар Плоскирева, среду Эндо или ксилозо-лизин-дезоксихалатный агар. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37±1°C в течение 18 - 20 часов, а в случае отсутствия роста чашки с посевами оставляют еще на 24 часа в термостате. С каждой чашки снимают подозрительные на сальмонеллы и шигеллы колонии в пробирки с дифференциально-диагностическими средами. Окончательное определение биохимических и серологических свойств, био- и сероваров проводят по действующим МУ 17.04-23/307-84 «Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых энтеробактериями».