ФБГОУ ВПО «САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ»
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Курсовая работа по санитарной микробиологии
«Санитарно-микробиологическое значение и методика выявления при санитарно-микробиологических исследованиях микроорганизмов рода Bacillus cereus»
Студента 4 курса, 2 группы
Факультета ветеринарно-санитарной экспертизы
ПЯТАКИНА КИРИЛЛА АЛЕКСЕЕВИЧА
Проверил преподаватель
Санкт-Петербург
Оглавление
Классификация……………………………………………………………………3
История изучения…………………………………………………………………5
Собственные исследования……………………………………………………....9
· Отбор и подготовка пробы продукта……………………………………..9
· Характеристика среды накопления и методика первичного посева…..11
· Характеристика плотной элективной среды и методика посева………12
· Учет роста на плотной элективной среде. Характеристика колоний…13
· Характеристика тестов, необходимых для дифференциации и идентификации данных микроорганизмов……………………………...14
Выводы по итогам курсовой работы…………………………………………...17
Список использованной литературы…………………………………………...18
Приложения……………………………………………………………………...19
Классификация
Тип: Фирмикуты
Класс: Бациллы
Порядок: Bacillales
Семейство: Bacillaceae
Род: Бациллы
Наиболее изученные виды: Bacillus cereus, Bacillus amarus, Bacillus amarus, Bacillus anthracoides, Bacillus anthracis, Bacillus bombycus, Bacillus bombycepticus, Bacillus crasus, Bacillus danicus, Bacillus fusiformis, Bacillus larvae, Bacillus megathеrium, Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides, Bacillus paraalvei, Bacillus polymixa, Bacillus vigratus
Морфология
Палочковидные (0,9-1,5 х 3-5 мкм), спорогенные хемоорганотрофные аэробные или факультативно-анаэробные бактерии из семейства Bacillaceae (под микроскопом клетки-палочки с обрубленными концами внешне напоминают восковые свечи). Эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки, жгутики – перетрихиально.
Бактерии морфологически сходны с Bасillus anthracis, но обладает подвижностью.
На селективном агаре образуют колонии диаметром 1,5-2 мм, окруженные зонами преципитата диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые, затем края колоний становятся изрезанными. Выросшие на агаре колонии имеют восковидный вид. 
На жидких средах Bacillus cereus образует хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона.
Культуральные свойства
Bac. cereus-аэроб, но может развиваться и при недостатке кислорода воздуха. На МПА вырастают крупные, распластанные, серовато-беловатые колонии с изрезанными краями, некоторые штаммы образуют розовато-коричневый пигмент, на кровяном агаре-колонии с широкими, резко очерченными зонами гемолиза; на МПБ - образует нежную пленку, пристеночное кольцо, равномерное помутнение и хлопьевидный осадок на дне пробирки. Все штаммы Bac. cereus интенсивно растут при рН от 9 до 9,5; при рН 4,5-5 прекращают своё развитие. Оптимальная температура развития 30-32 С, максимальная 37-48С, минимальная 10С.
Биохимические свойства
Bac. cereus свертывает и пептонизирует молоко, вызывает быстрое разжижение желатина, способен образовывать ацетилметилкарбинол, утилизировать цитратные соли, ферментирует мальтозу, сахарозу. Некоторые штаммы способны расщеплять лактозу, галактозу, дульцит, инулин, арабинозу, глицерин. Манит не расщепляет ни один штамм.
История изучения
Описываемый микроорганизм был открыт и назван Bacillus cereus в 1888 г., синонимы: Bacillus pseudoanthracis и Bacillus anthracoides. В определитель микробов Берджи (1957) этот микроорганизм входит под своим первоначальным названием, которое является общепринятым в современной литературе. По систематическому положению Bacillus cereus относится к роду Bacillus, к группе апатогенных аэробных спорообразователей, т. е. по первичной характеристике они были отнесены к сапрофитам. Вследствие этого длительное время оставалась неизученной их роль в патологии человека. Правда, в отдельных сообщениях содержались, описания возбудителей отравлений, изолированных из пищи, которых можно было отнести к Bacillus cereus, но авторы ошибочно относили их к другим видам бактерий.
Место обитания в природных условиях
Основной средой обитания Bacillus cereus является почва с нейтральной или слабощелочной реакцией. Из почвы патоген попадает в воздух, воду, пищевые продукты, на одежду и руки людей, кожные покровы животных, на поверхность оборудования пищевых предприятий. Из кишечника здоровых людей и животных Bacillus cereus выявляется редко и в небольших количествах.
Пути распространения и попадания в пищевые продукты
Диапазон продуктов, из которых могут быть выделены Bacillus cereus, довольно велик и включает: рис, молочные продукты, специи, сушеные продукты и овощи. Перекрестное загрязнение может привести к распространению спор или вегетативных форм в другие продукты, например мясо. В период сбора урожая, в областях производства продуктов питания, споры Вacillus сereus могут поражать растительное сырье и оборудование, применяемое в пищевой промышленности. К примеру, во время выпаса крупного рогатого скота споры Bacillus сereus из окружающей среды попадают на вымя коров, вследствие чего клетки Bacilus сereus – часто выделяют из молока, которое приобретает специфический дефект известный как сладкое коагулирование.
Учитывая повсеместное распространение Bacillus сereus, устойчивость его спор, и неприхотливость этого микроорганизма, любой вид пищевых продуктов с рН > 4,8 может быть заражен этим возбудителем. Несоблюдение правил приготовления пищи, таких как медленное и недостаточное охлаждение или хранение продуктов при температуре окружающей среды, может способствовать росту Bacillus сereus в составе продуктов и приводить к развитию пищевых отравлений.
Устойчивость
Bacillus cereus является спорообразующим микробом, поэтому обладает значительной устойчивостью к нагреванию, высушиванию, высоким концентрациям поваренной соли и сахара. Так, Bacillus cereus часто обнаруживают в пастеризованном молоке (65-93С), в консервах. В мясо она попадает при убое скота и разделке туш. Особенно активно палочка цереус развивается в измельченных продуктах (котлеты, фарш, колбаса), а также в кремах. Микроб может развиваться при концентрации поваренной соли в субстрате до 10-15%, а сахара-до 30-60%. Кислая среда действует на него неблагоприятно. Наиболее чувствителен этот микроорганизм к уксусной кислоте.
Bacillus cereus как возбудитель болезней человека
С Bacillus cereus связывают два типа пищевых отравлений – рвотное и диарейное. Обе формы, как правило, не острые и самокупирующиеся, но встречаются тяжелые и даже летальные случаи. Bacillus cereus официально были признаны бактериями, вызывающими рвотные пищевые отравления в 1950-х годах. Заболевание представляет собой интоксикацию рвотным токсином, получившим название «cereulide». Токсин образуется до момента попадания в пищу. Характерные черты течения заболевания - тошнота и рвота, наблюдающиеся всего несколько часов после еды. Инкубационный период короткий – от 30 минут до 6 часов (Таблица 1). Продолжительность рвотного синдрома в норме 6-24 часа. В постановке окончательного диагноза важное значение играет дифференциальная диагностика бациллярного отравления от отравления энтеротоксинами Staphylococcus aureus, которое вызывает похожие симптомы. Однако, в вышеописанном заболевании рвота часто сопровождается еще и диареей. Было зарегистрировано несколько тяжелых и даже смертельных случаев рвотного пищевого отравления.
Диарейный синдром – токсикоинфекция, вызванная попаданием вегетативных клеток или спор в ЖКТ и соответственно выработкой ими энтеротоксинов в тонком кишечнике. Его легко спутать с отравлениями вызванными другими спорообразующими бактериями – Clostridium perfringens, но что характерно – проявляется болями в животе, водной диареей и иногда тошнотой и рвотой. Инкубационный период в норме – 8-16 ч, в среднем 12 ч, в редких случаях более длительный. Продолжительность заболевания 12-24ч, но так же есть случаи с продолжительностью до нескольких дней. Возникновение конкретной формы пищевого отравления зависит от внешних условий размножения бактерий, определяющих возможность проявления токсигенного потенциала Bacillus cereus. Диагностика пищевого отравления, вызванного Bacillus cereus, основана на изоляции и идентификации аналогичных штаммов и оценке общего количества бактерий в материалах от больного и в подозреваемом пищевом продукте.
| Характеристики | Диарейный синдром | Рвотный синдром |
| Тип токсина | Белок; энтеротоксины(ы): Hbl, Nhe | Цикличный пептид; рвотный токсин (cereulide) |
| Локализация продукции токсина | В тонком кишечнике | Заранее сформирован в пище |
| Инфекционная доза | 105–108Для спор требуется меньшее число клеток чем для вегетативных форм | 105–108 Часто обнаруживают в зараженной пище, живые клетки не обязательны для заражения Cereulide: 8–10 μg kg−1 веса тела (животные модели)† |
| Инкубационный период | 8–16 ч (иногда >24 ч) | 0.5–6 ч |
| Продолжительность болезни | 12–24 ч (иногда несколько дней) | 6–24 ч |
| Симптомы | Боли в животе, водянистый понос, а иногда тошнота. Летальность встречается | Тошнота, рвота и недомогание. Несколько смертельных случаев (возможно, из-за повреждения печени) |
| Часто зараженная пища | Белковые продукты; мясные продукты, супы, овощи, пудинги, соусы, молоко и молочные продукты | Продукты богатые крахмалом; жареный и вареный рис, макаронные изделия, кондитерские изделия и лапша |
Нормативные документы, МУК, определяющие методики их выявления
ГОСТ 10444.8-88. Продукты пищевые. Метод определения Bacillus cereus
ГОСТ 10444.8-2013 (ISO 7932:2004) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета презумптивных бактерий Bacillus cereus. Метод подсчета колоний при температуре 30 °C
ГОСТ ISO 21871-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus
Собственные исследования
Отбор и подготовка пробы продукта
Для собственных исследований мною было выбрано молоко с подозрением на наличие Bacillus cereus. Для того, чтобы микроорганизм вышел из фазы споры и перешел в фазу активного размножения, молоко было оставлено на 6 часов при комнатной температуре.
Для улучшения качества проб был сделан ряд последовательных десятикратных разведений: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.
Характеристика среды накопления и методика первичного посева
Средой накопления для Bacillus cereus является кровяной агар.
Основу среды составляет смесь пептонов, разработанная специально для прихотливых микроорганизмов. Среда содержит кровь, что позволяет определить тип гемолиза – один из основных ориентировочных тестов при идентификации бактерий.
Для посева на кровяной агар профламированой бактериологической петлей берут каплю пробы осторожно засевают поверхность питательной среды по секторам, слегка касаясь поверхности среды, чтобы посев был поверхностным.
Бактериологической петлей с посевным материалом несколько раз делают параллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с питательным агаром. Петлю прожигают в пламени горелки, дают остыть и часть материала из первого сектора аналогичным образом распределяют во втором секторе, затем в третьем и четвертом секторах. 
Посев по секторам на кровяной агар
Характеристика плотной элективной среды и методика посева
Желточный агар с полимиксин сульфатом применяется в качестве элективной среды для Bacillus cereus согласно ГОСТ 10444.8-88 
Среда содержит пептический перевар животной ткани и мясной экстракт, которые служат источником углерода, азота, минеральных веществ, витаминов В и других важных факторов роста данных бактерий. Маннит служит ферментируемым углеводом. Кислые продукты ферментации маннита изменяют цвет фенолового красного и соответствующие колонии окрашиваются в желтый цвет. Включение в состав среды яичного желтка позволяет определить лецитиназную активность: в присутствии лецитиназы вокруг соответствующих колоний формируется зона белого преципитата. Полимиксин В подавляет рост таких грамотрицательных бактерий, как кишечная и синегнойная палочки. Такая среда позволяет дифференцировать Bacillus cereus от других бацилл по ферментации маннита и характеру спорообразования. Микроорганизмы, не относимые к Bacillus cereus, часто вызывают диффузное пожелтение среды при ферментации маннита, что мешает дифференцировать колонии по этому признаку. В этом случае рекомендуется проверить ферментацию маннита у чистой культуры на свежей среде.
Посев проводился по секторам.
Методика посева по секторам: бактериологической петлей с посевным материалом несколько раз делают параллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с питательным агаром. Петлю прожигают в пламени горелки, дают остыть и часть материала из первого сектора аналогичным образом распределяют во втором секторе, затем в третьем и четвертом секторах.
Учет роста на плотной элективной среде. Характеристика колоний
Колонии красного цвета, с ореолом вокруг, что указывает на лецитиназную активность. Колонии крупные, шероховатые.
Характеристика тестов, необходимых для дифференциации и идентификации данных микроорганизмов
Есть два возможных пути дифференциации данного микроорганизма. Первый путь предполагает выделение Bacillus cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта или его разведения на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к Bacillus cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам.
Для определения используются справочные данные:
Все эти тесты занимают время, и это их главный недостаток.
Для быстрого результата используется Иммунохроматографический экспресс-тест Duopath® Cereus Enterotoxin. Он основан на обнаружении энтеротоксинов HBL (гемолизин) и NHE (негемолитический энтеротоксин) Bacillus cereus в пищевых продуктах
 |
Выводы
Bacillus cereus – это повсеместно встречающиеся грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки. Bacillus сereus выделяется из продуктов сравнительно часто, что делает этот вид бактерий значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее частому риску заражения – это мясные и молочные продукты, овощи, супы, специи и, в особенности, продукты детского питания. Почти все штаммы Bacillus сereus продуцируют токсины. Цитотоксические энтеротоксины продуцируют почти 95% изолятов Bacillus сereus. Из них негемолитический энтеротоксин (NHE) продуцируют более чем 90% штаммов, а гемолизин BL (HBL) около 55% исследованных штаммов. Полагают, что HBL и NHE образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами Bacillus сereus. Критерии санитарной оценки продуктов, загрязненных Bacillus cereus окончательно не разработаны. В сырье не должно содержаться более 100 микробных клеток Bacillus cereus (в 1г). В пастеризованных консервах наличие Bacillus cereus не допускается. Накопление в продуктах микроорганизмов в пределах 10и более не приводит к значительному изменению внешнего вида продукта. При этом этот микроорганизм опасен, так как зафиксированы случаи летального исхода. В связи с этим необходимо дальнейшее и более подробное изучение Bacillus cereus и разработка методов предотвращения его попадания в пищу, необходим строгий контроль продуктов питания на всех этапах производства и должны разрабатываться новые, более совершенные методы диагностики.
Список используемой литературы
1 М.А. Сидоров, Р.П. Корнелаева "Микробиология мяса и мясопродуктов" 3е издание. Москва "Колос" 1998
2 П.П. Степаненко "Микробиология молока и молочных продуктов" Москва 1999
3 https://www.himedialabs.ru/
4 ГОСТ 10444.8-88Продукты пищевые. Метод определения Bacillus cereus
5 Васильев Д.Д., Калдыркаев А.И., Феоктистова Н.А., Алёшкин А.В. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики. Ульяновск, 2013.
6 9. Lotte P. Stenfors Arnesen, Annette Fagerlund andPer Einar Granum. «From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins.» FEMS Microbiology Reviews (2008)
7 А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков, «Медицинская и санитарная микробиология», Москва, 2003
Приложения
Определение фосфотазной активности Bacillus cereus
Определение оксидазы Bacillus cereus (положительная реакция)
Наличие зоны лизиса вокруг колоний Bacillus cereu sпри определении ДНКазной активности
Определение каталазной активности