РАЗДЕЛ: «ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ »
Занятие 6. Дата ______. Тема: «Принципы культивирования бактерий. Выделение и идентификация чистых культур бактерий. Культивирование анаэробов Дезинфекция, антисептика, стерилизация и асептика. Микрофлора воды и воздуха»
Таблица 4. Методы стерилизации и аппаратура
| Стерилизуемый материал | Метод стерилизации | Режим стерилизации |
| ü Инфекционный материал | Автоклавирование | 1,5-2 атм., 131оС, 20-25 мин. |
| ü Среды, не содержащие веществ, разлагающихся при 120оС ü Бактериальные фильтры | Автоклавирование | 1 атм., 120оС, 20 мин. |
| ü Среды, не выдерживающие нагревания до 120оС ü Мембранные фильтры | Автоклавирование | 0,5 атм., 110оС, 15-30 мин. |
| ü Среды, не выдерживающие нагревания выше 100оС | Дробная стерилизация | Текучий пар, 60оС, 3 раза по 30-40 мин., через сутки |
| ü Свернутая сыворотка, яичные среды | Аппарат Коха | До 65оС 3 раза по 45 мин., через сутки |
| ü Питательные среды и вещества, разрушающиеся при нагревании | Фильтрование через стерильные бактериальные фильтры: фильтры Зейтца, свечи Шамберлана или Беркефельда | Фильтрование |
| ü Колбы, пробирки, чашки Петри, пипетки и прочая стеклянная посуда и инструменты | Печь Пастера | 165-170оС, 45 мин. |
5. Классификация питательных сред
| Группа питательных сред | Жидкие | Плотные |
| Основные (простые) | ||
| Простые среды | Мясо-пептонный бульон (МПБ) | Мясо-пептонный агар (МПА) |
| Специальные (сложные) | ||
| А. Сложные специальные | ¨ Сахарный МПБ для стрептококков и др. | ¨ Сахарный МПА ¨ 5% кровяной агар и др. |
| Б. Элективныеилиизбирательные (преимущественно растет определенный вид микроорганизмов, другие не растут или растут плохо) | ¨ 1% щелочная пептонная вода для холерного вибриона ¨ 10% желчный бульон для сальмонелл и др. | ¨ Желточно-солевой агар (ЖСА) для стафилококков ¨ Свернутая сыворотка для дифтерийной палочки ¨ Кровяной агар с ванкомицином для бактероидов и др. |
| В. Среды обогащения (всегда жидкие; используются для накопления микробов определенного вида) | ¨ Селенитовый бульон для дизентерийной палочки ¨ 10% желчный бульон для сальмонелл и др. | ________ |
| Г. Дифференциально-диагностические (применяются для первичной дифференциации бактерий преимущественно по биохимическим свойствам, а также для идентификации бактерий) | ¨ Среды Гисса (“пестрый ряд” для определения сахаролитической активности бактерий) | ¨ Среда Эндо ¨ Среда Левина ¨ Среда Плоскирева ¨ Среды Гисса (полужидкие) и др. |
| Д. Хромогенные (всегда плотные; применяются для дифференциации бактерий по культуральным свойствам) | ________ | ¨ «УриселектТМ » и др. |
| Е. Транспортные (для доставки исследуемого материала в лабораторию) | ¨ Среда Стюарта и др. | ¨ Среда Стюарта (полужидкая) и др. |
| Синтетические | ||
| -------- | ¨ Среда Сотона |
Протокол “ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ”
(бактериологический метод исследования)
1 ЭТАП. Посев исследуемого материала на чашки Петри с плотной питательной средой (МПА) методом штриха.
Инкубация при 37оС в течение 24 часов.
Примечание 1: в том случае, если в исследуемом материале содержится незначительное количество возбудителя (например, в крови), то его предварительно накапливают путем посева материала в жидкую питательную среду (см. среды обогащения), а затем после инкубации (как правило, при 37оС в течение 18-24 часов) производят пересев на плотную среду.
Примечание 2: выделение и идентификация чистой культуры анаэробов производится в анаэробных условиях.
2 ЭТАП. Идентификация выделенной чистой культуры (чистых культур) по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам. Для этого проводят:
а) макро- и микроскопическое исследование колоний, выросших на плотной питательной среде (культуральные свойства);
б) приготовление мазка из половины колонии каждого вида и окраску препарата по Граму (морфологические и тинкториальные свойства);
Примечание: микроскопия материала из колоний производится также с целью проверки чистоты культуры.
в) пересев оставшейся части колонии на скошенный агар для накопления выделенной чистой культуры. Инкубация при 37оС в течение 24 часов.
Таблица 6. Схема описания колоний
| № | Размеры | Форма | Цвет | Поверхность | Края | Консистенция | Структура | Морфология; Окраска по Граму | Предполагаемый возбудитель |
ЭТАП.
А. Идентификация выделенной чистой культуры бактерий по биохимическим, антигенным и др. свойствам.
Для этого производят следующие исследования:
а) изучение однородности роста на скошенном МПА;
б) приготовление, окраска мазка по Граму (или фуксином) и микроскопия для проверки чистоты выделенной на скошенном МПА культуры;
в) изучение биохимической активности бактерий: посев выделенной чистой культуры на среды Гисса (для определения сахаролитической активности), желатини МПБ с индикаторными бумажками на индол, аммиак и сероводород (для выявления протеолитической активности). Инкубация при 37оС в течение 24 часов.
Примечание 1: изучение биохимических свойств проводят только при работе с чистой культурой бактерий. При этом определяют свойства каждого выделенного микроорганизма в отдельности. Если при микроскопии мазка из материала со скошенного МПА обнаруживается смесь бактерий, то процедуру выделения чистой культуры бактерий необходимо повторить.
Примечание 2: для адекватной оценки биохимической активности бактерий необходимо исследовать не менее 15-20 тестов!
Таблица 7. Ферментативные свойства бактерий
| Предполагаемый возбудитель | САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА | ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА | |||||
| Лактоза | Глюкоза | Мальтоза | Маннит | Сахароза | Индол | Сероводород | |
г) изучение антигенных свойств выделенных бактерий (будет проводиться в разделе:”ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ”).
Б. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Инкубация при37оС в течение 24ч.
В. Внутривидовая идентификация выделенной чистой культуры бактерий (эпидемиологическое маркирование). Проводится часто с целью определения источника инфекции. С этой целью применяют фаготипирование, рестрикционный анализ, определение плазмидного профиля бактерий и др. исследования.
ЭТАП. Учет результатов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств бактерий, выделенных из исследуемого материала, можно сделать вывод об их принадлежности к виду __________________________ и виду ____________________________________.
Таблица 8. Определение количества бактерий в исследуемом материале (метод серийных разведений)
| Разведение материала | 10- | 10- | 10- |
| Засеваемый объем, мл | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Результат (количество колоний): | |||
| Расчет: | |||
| ЗАКЛЮЧЕНИЕ: количество бактерий в исследуемом материале _________________ КОЕ/мл |
Рисунок 1. Культуральные свойства бактерий. Характер роста бактерий на жидких питательных средах
| Пленка на поверхности (аэробы) | 
| Придонный рост (микроаэрофилы) |
| Диффузный рост (факультативные анаэробы) |
|
Рисунок 2. Культуральные свойства бактерий. Пигменты бактерий
| Staphylococcus aureus | 
| S. epidermidis |
| Micrococcus luteus |
| Pseudomonas aeruginosa |
| Serratia marcescens |
|
|
Рисунок 3. Рост бактерий на среде Эндо
 |
| Лактозопозитивные бактерии |
| Лактозонегативные бактерии |
Таблица 9. Биохимические свойства стафилококков и эшерихий
| Название бактерий | Сахаролитические свойства, рост на средах Гисса с: | Протеолитические свойства, рост на МПБ | |||
| глюкозой | лактозой | маннитом | сахарозой | ||
| ü Незасеянные пробирки | 
|
|
|
|    
|
| ü S. aureus |
|
|
|
|
|
| ü E. coli |
|
|
|
|
|
Занятие 7. Дата ______. Тема: «Бактериологический метод исследования (продолжение). Идентификация чистых культур бактерий по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам. Микрофлора человека»
_Мазок зубного налета
_____________________
 |
Окраска ___________
Таблица 10. Нормальная микрофлора человеческого организма
| Локализация (биотоп) | Типичные представители | Морфологические и тинкториальные свойства |
| КОЖА | · Staphylococcus sp. · Streptococcus sp. · Propionobacterium sp. · Corynebacterium sp., и пр. | Грамположительные кокки Грамположительные кокки Грамотрицательные палочки Грамположительные палочки |
| НОСОГЛОТКА | · Streptococcus sp. · Neisseria sp. · Haemophilus sp. · Bacteroides sp. · Leptotrichia sp. · дифтероиды · спирохеты, и пр. | Грамположительные кокки Грамотрицательные кокки Грамотрицательные палочки Грамотрицательные палочки Грамотрицательные извитые Грамположительные палочки Грамотрицательные извитые |
| ТОЛСТЫЙ КИШЕЧНИК | · Lactobacillus sp. · Bifidobacterium sp. · Bacteroides sp. · Clostridium sp. · Enterococcus sp. · E.coli, и др. | Грамположительные палочки Грамположительные ветвящиеся Грамотрицательные палочки Грамположительные палочки Грамположительные кокки Грамотрицательные палочки |
| ВЛАГАЛИЩЕ | · Streptococcus sp. · Lactobacillus sp. · Bacteroides sp. и др. | Грамположительные кокки Грамположительные палочки Грамотрицательные палочки |
Занятие 8. Дата ______. Тема: «Бактериологический метод исследования (продолжение). Ферменты бактерий. Идентификация чистых культур бактерий по биохимическим свойствам. Антибиотики. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам»
Таблица 11. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений
| Ингредиенты | контроль | |||||||
| МПБ, в мл | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Пенициллин, ЕД/мл | 0,5 | 0,25 | 0,125 | 0,06 | 0,03 | -- | ||
| Стафилококк | по одной “петле” | |||||||
| Результаты(рост/отсутствие роста): | ||||||||
| ЗАКЛЮЧЕНИЕ: минимальная ингибирующая концентрация (МИК) пенициллина____ЕД/мл |
Таблица 12. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар (методом дисков)
| Вид бактерий | Антибиотик, диаметр зоны задержки роста, мм | |||||
| цефалексин | доксициклин | |||||
| S. aureus | ||||||
| E. coli | ||||||
| ЗАКЛЮЧЕНИЕ: выделенные бактерии вида Staphylococcus aureus чувствительны к ________________________________________________, устойчивы к ____________________; выделенные бактерии вида Escherichia coli чувствительны к __________________________, устойчивы к ______________________________________________________. |
Рисунок 4. Схема определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков
Антибиотики:
Ø 
Цефалексин -
Ø 
Ø
Ø 
Ø
Занятие 9. Дата ______. Тема: «Генетика бактерий. Механизмы передачи генетической информации у бактерий. Генетические методы диагностики, применяемые в микробиологии. Принципы культивирования облигатных внутриклеточных паразитов»