Содержание РНК во всех клетках живого организма непостоянно. Оно может меняться в зависимости от вида, возраста, физиологического состояния организма и ткани. Обычно в молодых клетках содержание РНК больше, чем в старых. Кроме того, в клетках содержатся различные по своим функциям и молекулярной массе виды РНК – рибосомная, транспортная и матричная.
Все это обуславливает значительные трудности в изучении биосинтеза рибонуклеиновых кислот. Считают, что синтез РНК может происходить несколькими путями. Мы рассмотрим один из них, так называемый ДНК-зависимый синтез РНК. С точки зрения передачи наследственной информации в процессе биосинтеза белков, наибольшее значение имеет синтез молекул РНК на участке молекулы ДНК как на матрице.
Исходными веществами, необходимыми для биосинтеза, являются рибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ); синтез катализируется ферментом РНК-полимеразой, сходной по своему действию с ДНК-полимеразой. Схема биосинтеза следующая:
Как известно, ДНК представляет собой двойную спираль. Но при матричном синтезе РНК на участке молекулы ДНК «копируется» только одна из двух ее цепей, которую называют значащая. Она служит матрицей.
Все синтезированные молекулы РНК имеют структуру, комплементарную матрице (т.е участку – гену одной из цепи ДНК).
Прежде чем начнется образование цепи РНК, фермент РНК-полимераза присоединяется к матрице не в любом ее месте, а к определенному участку – который называется промотором. На этом участке молекулы ДНК есть последовательности нуклеотидов, узнаваемые РНК-полимеразой.
Связывание РНК-полимеразы с промотором приводит к локальному (местному) расхождению нуклеотидных цепей, в этом участке ДНК одна из цепей ДНК служит матрицей.
Наращивание молекулы РНК происходит в результате перемещения РНК-полимеразы вдоль ДНК путем присоединения очередного рибонуклеотида, комплементарного тому дезоксирибонуклеотиду ДНК, который в данный момент находится в области активного центра РНК-полимеразы.
В молекуле ДНК закодированы не только участки, с которых начинается синтез РНК, но и последовательности нуклеотидов, сигнализирующих о прекращении синтеза РНК. С этими участками, по-видимому, связываются определенные белки, останавливающие действие РНК-полимеразы. Таким образом, получаются отдельные молекулы РНК, каждая из которых содержит информацию одного гена. Синтез РНК происходит в направлении от 5¢- конца к 3¢- концу.
В клетках высших организмов обнаружено три типа ДНК-зависимых РНК-полимераз. Они катализируют синтез рибосомной, матричной и транспортной РНК.
Все виды РНК образуются на ДНК-матрице в виде крупных молекул предшественников, которые затем подвергаются значительным изменениям –созреванию. При созревании, под действием ферментов, от них постепенно отщепляются лишние нуклеотиды, а у тРНК происходит метилирование и восстановление части оснований.
49.
Биологический код
Биосинтез белков, или трансляция, отличается от биосинтеза ДНК и РНК (репликации ДНК и трансляции РНК) двумя принципиальными особенностями: между мРНК (матрицей) и пептидной цепью белка, которая на этой матрице синтезируется, нет комплементарного соответствия, т.е. структура рибонуклеотидов (мономеров матрицы) и аминокислот (мономеров белка) такова, что избирательные взаимодействия между ними, подобные образованию пар А…Т или Г…Ц, невозможны, нет соответствия между числом мономеров – нуклеотидов в матрице и в продукте реакции (в мРНК 4 разных нуклеотида, в белке 20 разных аминокислот);
Поэтому механизм использования матрицы при биосинтезе белка отличается от использования матриц при репликации и транскрипции.
Способ записи информации о первичной структуре белков в нуклеиновых кислотах получил название биологического кода (его также называют генетическим, нуклеотидным, аминокислотным кодом).
Один из первых вопросов, который возникает при выяснении структуры биологического кода, – это вопрос о кодовом числе; т.е. о числе нуклеотидных остатков, кодирующих включение в белок одной аминокислоты. Очевидно, что кодовое число не может быть равным единице, так как в этом случае с помощью четырех нуклеотидов можно было бы закодировать только четыре аминокислоты. При кодовом числе 2 количество разных нуклеотидных пар будет равно числу перестановок из четырех элементов по 2, т.е равно 42 = 16, что тоже недостаточно для кодирования всех аминокислот. Число разных троек нуклеотидов равно 43 = 64. Это в три с лишним раза превышает минимальное число необходимое для кодирования 20 аминокислот. Экспериментально доказано, что в биологическом коде кодовое число равно трем: тройку нуклеотидных остатков (триплет), кодирующих включение одной аминокислоты, называют кодоном.
Из 64 кодонов (триплетов), (табл.1) 61 используется для кодирования аминокислот, а три – УАА, УAГ и УГA – обозначают конец матрицы: на этих триплетах обрывается дальнейшее наращивание пептидной цепи – терминирующие кодоны. Каждый триплет кодирует только какую-нибудь одну аминокислоту. Это свойство кода называют специфичностью. С другой стороны, одна аминокислота может кодироваться двумя или большим числом (до шести) разных триплетов, т.е. код вырожденный, но первые два нуклеотида для данной аминокислоты всегда одинаковы. Непрерывность кода белкового синтеза состоит в том, что все входящие в его состав кодоны располагаются в мРНК, кодирующей биосинтез определенного белка, в строгом порядке один возле другого, не будучи разделенными иными моно- или олигонуклеотидными вставками. Неперекрывающийся характер кода заключается в том, что ни один из нуклеотидов одного кодона не является составной частью другого (соседнего) кодона.
К настоящему времени биологический код изучен у всех биологических объектов (от вирусов и бактерий до высших животных). Во всех случаях он оказался одинаковым. Эта универсальность кода свидетельствует о единстве происхождения всех форм жизни на Земле. Биосинтез белков – трансляция
Сборка полипептидной цепи белка из составляющих ее аминокислот включает четыре стадии: активацию и отбор аминокислот; инициацию синтеза полипептидной цепи; элонгоцию (удлинение) полипептидной цепи; терминацию синтеза полипептидной цепи.
Первая стадия – активация – это превращение аминокислоты в аминоацил – тРНК.
Взаимодействие тРНК с аминокислотами – ферментативный процесс, приводящий к образованию ковалентной сложноэфирной связи между аминокислотой и тРНК.
синтетаза
Аминокислота + АТФ + т РНК–––––® Аминоацил – тРНК + АМФ+ Н4Р2О7
Известно не менее двадцати различных аминоацил – тРНК – синтетаз, каждая из которых катализирует реакцию только одной из 20 аминокислот с тРНК, соответствующей этой аминокислоте. Каждая синтетаза высокоспецифична, в ее активном центре находится участок, комплементарный какой-то части молекулы одной из тРНК. Это позволяет каждой синтетазе соединять определенную аминокислоту с соответствующей тРНК.
Вторая стадия синтеза белка – инициация – начинается с образования инициирующего комплекса.
Поступившая из ядра в цитоплазму мРНК соединяется с малой (40 S) субъединицей рибосомы и инициирующим ей аминоацилом – тРНК. Затем к этому комплексу присоединяется большая (60 S) субъединица рибосомы.
Инициирующий аминоацил – тРНК – содержит аминокислоту метионин – Меt – тРНК. В дальнейшем Меt – тРНК взаимодействует своим триплетом нуклеотидов, комплементарным кодом АУГ или ЦУЦ на мРНК. Эти два кодона на мРНК называют инициирующими. С одного из них начинается синтез любого белка.
Третья стадия – элонгация. Процесс элонгации начинается со связывания аминоацил – тРНК – с инициирующим комплексом, соответствующим первому кодону мРНК, следующему за инициирующим кодоном. Кодон мРНК должен спариваться с антикодоном, т.е. с таким триплетом в молекуле тРНК, который комплементарно ему соответствует. Эта тРНК взаимодействует затем не только с мРНК, но и с определенными участками рибосомы – центрами связывания – пептидильным (донорным) и акцепторным. В процессе связывания аминоацила – тРНК– расходуется одна молекула ГTФ. Затем начинается образование пептидной связи между инициаторным метионином из Меt-тРНК и первой в будущей полипептидной цепи аминокислотой, включенной в аминоацил-тРНК. Образовавшийся дипептидил – тРНК – связан с кодоном, соответствующим аминокислоте, и центром связывания рибосомы.
Затем происходит транслокация – перемещение рибосомы относительно мРНК и дипептидил-тРНК. В результате этого перемещения дипептидил-тРНК оказывается в пептидильном центре рибосомы, а тРНК метионина освобождается из комплекса. На транслокацию расходуется две молекулы ГTФ.
Дальнейшее удлинение пептидной цепи происходит путем повторения этих фаз, но теперь уже присоединяется аминоацетил-тРНК, соответствующий второму коноду мРНК, в результате чего образуется трипептид и т.д. МС– малая субчастица рибосомы (40S); БС – большая частица рибосомы (60S); РПЦ и ЗПЦ – растущая и завершенная полипептидные цепи; ИП1 и ИП2 – кодоны – инициаторы и участок, узнаваемый рРНК; Т1 и Т2 – кодоны–терминаторы, прерывающие синтез белка.
Остаток аминокислоты инициаторного метионина, участвовавший в стадии инициации и занимающий в растущей пептидной цепи N-концевое положение, отщепляется в стадии элонгации.
Следует отметить, что метионин, встраиваемый не в начало цепи (инициаторный метионин), а внутри – переносится другой тРНК.
Четвертая стадия – терминация. Удлинение пептидной цепи продолжается до тех пор, пока на пути рибосомы не встретится один из терминальных триплетов мРНК. Это триплеты УAA, УAГ или УГA, сигнализирующие окончание синтеза полипептидной цепи. В узнавании этих терминальных конодов участвуют внерибосомные белки – факторы терминации или факторы высвобождения белка, под действием которых происходит гидролитическое расщепление связи между полипептидом и последней тРНК, и высвобождается полипептидная цепь готового белка. После освобождения полипептидной цепи фактор высвобождения, а также мРНК диссоциируют. У растений обнаружен лишь один фактор.
Вторичная и третичная структуры белков формируются в процессе трансляции по мере удлинения пептидной цепи. Как уже отмечалось в разделе «Белки», пространственные структуры белковой молекулы определяются первичной структурой ее полипептидной цепи. В результате формирования вторичной и третичной структур образуются активные центры белков.
В то же время в процессе трансляции и после ее завершения не всегда формируется биологически активный белок. В ряде случаев сформированные молекулы белков-ферментов неактивны, и переход их в активную форму возможен после отщепления части полипептидной цепи путем частичного гидролиза. Так, например, в созревающих семенах ферменты протеазы синтезируются в неактивной форме, они не способны гидролизовать собственные запасные белки до прохождения частичного гидролиза полипептидной цепи молекулы фермента. Только после частичного гидролиза, в результате которого отщепляются трипептид, протеаза переходит в активную форму и начинает гидролизовать запасные белки семян. Продукты гидролиза белков поступают в прорастающий зародыш семени.
Присоединение к молекуле белка простетической группы – кофермента или металла, объединение олигомерных белков в четвертичную структуру также происходят уже после завершения процесса трансляции. В некоторых белках после завершения синтеза полипептидной цепи происходит модификация аминокислотных остатков, например, присоединение дополнительных метильных групп, йодирование, окисление двух остатков цистеина с образованием дисульфидного мостика, гидроксилирование остатков пролина, присоединение сахаров к остатку аспарагина при образовании гликопротеинов, фосфорилирование гидроксильных групп серина или тирозина у некоторых ферментов, присоединение КоА в ацилпереносящем белке синтетазы жирных кислот.
В реальной живой клетке синтез белков протекает не на одной рибосоме, а на комплексе или кластере рибосом – полисоме. Каждая стадия трансляции (инициация, элонгация и терминация) осуществляется каждой рибосомой. Обычно кластеры содержат от 3 до 20 рибосом, но очень большие молекулы мРНК, состоящие из тысяч нуклеотидов, могут образовывать комплексы, содержащие от 50 до 100 рибосом. Скорость синтеза полипептида очень высока: синтез пептида из 100 аминокислот занимает около 2 минут.
50.
Переваривание белков
Белки, поступившие в организм с пищей, в желудочно-кишечном тракте расщепляются до аминокислот при действии группы протеолитических ферментов – пептидгидролаз (по современной номенклатуре); широко известно их тривиальное название – протеазы, или протеиназы. Эти ферменты катализируют гидролитическое расщепление пептидной связи в белках.
Протеолитические ферменты животных и человека изучены достаточно хорошо, в меньшей степени исследованы растительные протеазы.
Для протеолитических ферментов характерен ряд общих свойств и особенностей.
Ферменты, расщепляющие белки, обладают относительной субстратной специфичностью, которая определяется:
– длиной полипептидной цепи;
– структурой радикалов аминокислотных остатков, образующих гидролизуемую пептидную связь;
– положением связи в полипептиде.
Внутренние пептидные связи расщепляются эндопептидазами, концевые – экзопептидазы:
Все протеолитические ферменты синтезируются в виде неактивных предшественников, называемых зимогенами или проферментами, и таким образом клетки защищены от контакта с активной формой фермента и автолиза. Превращение зимогена в активный фермент происходит путем необратимой ковалентной модификации зимогена за счет локального протеолиза, т.е. разрыва одной или нескольких пептидных связей и отщепления ограниченного числа аминокислотных остатков. Это вызывает конформационные изменения в полипептиде, достаточные для формирования пространственной структуры активного центра фермента.
Расщепление пищевых белков начинается с действия протеолитического фермента – пепсина. В клетках слизистой оболочки желудка пепсин содержится в неактивной форме, называемой зимогеном – пепсиногеном. Специализированные клетки эпителия желудка секретируют соляную кислоту, создавая в желудке кислую среду (рН~1,5-2,0). Этот фактор имеет важное значение в переваривании белков: денатурирует белки пищи, оказывает бактерицидное действие, убивая попадающие с пищей микроорганизмы, является инициирующим фактором активации пепсиногена и превращения его в активную форму. В кислой среде желудочного сока некоторые группы пепсиногена протонируются, изменяется его конформация, в результате чего пепсиноген приобретает протеолитическую активность. При этом субстратом активированного пепсиногена служит тоже пепсиноген: одна молекула пепсиногена отщепляет от другой молекулы пепсиногена N – концевую часть включающую 42 аминокислотных остатка. В результате образуется фермент пепсин. Образовавшийся пепсин также может катализировать превращение пепсиногена в пепсин. В этом случае активацию можно представить как циклический процесс с механизмом обратной связи: продукт реакции пепсин ускоряет свое собственное образование.
В результате действия пепсина белки в желудке распадаются на полипептиды; свободные аминокислоты при этом практически не образуются. Пепсин наиболее активно гидролизует пептидные связи, NH2- группа которых принадлежит ароматическим аминокислотам – тирозину, фенилаланину, триптофану.
Дальнейшее превращение высокомолекулярных пептидов и белков, не расщепленных пепсином, происходит тремя эндопептидазами, вырабатываемыми поджелудочной железой в виде предшественников – трипсиногена, химотрипсиногена и проэластазы.
Активация трипсиногена происходит при участии фермента энтеропептидазы, выделяемого клетками кишечника. Энтеропептидаза отщепляет N-концевой гексапептид трипсиногена, в результате чего происходит изменение конформации оставшейся части молекулы и формируется активный центр – получается фермент трипсин. Основное количество трипсиногена активируется трипсином путем аутокатализа.
Трипсин обладает сравнительно узкой субстратной специфичностью, разрывая пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина и аргинина, т.е. основных аминокислот.
В поджелудочной железе синтезируется ряд химотрипсинов (a-, b-, p– химотрипсины) из двух предшественников – химотрипсиногена А и химотрипсиногена В. Активируются зимогены в кишечнике под действием активного трипсина и химотрипсина.
Рисунок 5 – Активация протеиназ в кишечнике
Химотрипсин обладает более широкой субстратной специфичностью, чем трипсин. Он катализирует гидролиз не только пептидов, но и эфиров, амидов и других ацилпроизводных, хотя наибольшую активность он проявляет по отношению к пептидным связям, в образовании которых принимают участие карбоксильные группы ароматических аминокислот – фенилаланина, тирозина и триптофана.
В поджелудочной железе синтезируется еще одна эндопептидаза – эластаза. Название фермент получил от субстрата эластина, который он гидролизует. Эластин богат глицином и аланином, содержится в соединительной ткани. Эластаза обладает широким спектром действия, гидролизуя субстраты, не расщепляемые трипсином и химотрипсином.
В превращении нативных белков и продуктов их гидролиза в тонком кишечнике активное участие принимают экзопептидазы. Карбоксипептидазы синтезируются в неактивном состоянии в поджелудочной железе и активизируются трипсином в кишечнике. Карбоксипептидаза А гидролизует пептидные связи С -концевых аминокислот, образованные преимущественно ароматическими аминокислотами (фенилаланин, тирозин, триптофан), а карбоксипептидаза В -связи, в образовании которых участвуют С -концевые лизин и аргинин.
Аминопептидазы вырабатываются в клетках слизистой оболочки кишечника сразу в активной форме. Из кишечного сока выделены два типа аминопептидаз, различающиеся по субстратной специфичности – аланинаминопептидаза и лейцинаминопептидаза, первая из которых гидролизует пептидную связь, образованную N -концевым аланином, а вторая способна гидролизовать практически любую пептидную связь, образованную N -концевой аминокислотой.
Процесс переваривания пептидов, их расщепление до свободных аминокислот в тонком кишечнике завершают три- и дипептидазы.