Многие структуры клетки находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Длина волны видимой части спектра лежит в пределах от 0,4 до 0,7 мкм, максимальное разрешение, полученное при этом с помощью светового микроскопа, может составлять 0,2 мкм. Открытие волновых свойств, присущих электронам, послужило основой для создания нового класса приборов — электронных микроскопов.
Максимальное разрешение, которое может быть получено в них при специальных условиях, составляет 0,2 нм, а увеличение может достигать 100— 200 тыс. раз.
Принципы работы электронного микроскопа
Принципиальная схема построения изображения в световом и электронном микроскопах сходна. Однако существует ряд отличий: в электронных микроскопах источником электронов служит катод, входящий в состав электронной пушки, в качестве линз используются электромагнитные катушки. В связи с тем, что в воздухе электроны могут проникать на незначительные расстояния, а затем их скорость гаснет, в электронном микроскопе с помощью специальных насосов создается высокий вакуум (10~4 мм рт. ст.).
В колонне микроскопа (тубусе), из которой откачан воздух, последовательно расположены катод (вольфрамовая нить), анод (металлическая пластинка с отверстием посередине), магнитные линзы, люминесцентный экран, фотопластинки ("магазин").
Ток, проходя через вольфрамовую нить катода, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов. Поданное на катод высокое напряжение создает большую разность потенциалов между катодом и анодом, что обеспечивает движение электронов к аноду и далее вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок сначала фокусируется первой магнитной линзой — конденсорной. Большая часть электронов, проходя через объект, не отклоняется. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой — объективной, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение снова увеличивается третьей магнитной линзой—проекционной.
При этом электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, а отклонившиеся электроны не доходят до экрана и не вызывают свечения. Изображение, полученное на люминесцентном экране, можно сфотографировать, если поднять экран, под которым расположен фотомагазин с фотопластинками, чтобы пучок электронов попал на фотопластинку.
II A. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования
Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей.
Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3).
Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации.
Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы.
Для приготовления срезов (толщиной 30—50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки.
Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов.
Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1—2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы.