ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить технологию культивирования продуцента антибиотика в глубиннойи поверхностной культурах.
ПРОГРАММА РАБОТЫ
1. Ознакомиться с основными сведениями о процессе поверхностной и глубинной ферментации микроорганизмов и факторами, влияющими на этот процесс.
2. Провести в стерильных условиях посев микроорганизма —продуцента антибиотика в питательные среды:жидкую и на сыпучий субстрат.
3. Провести описание характера развития продуцента антибиотика на агаризованной среде.
4. Осуществить процесс глубинной и поверхностной ферментации соответственно в жидкой питательной среде и сыпучем субстрате.
ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ
Микроорганизмы являются неиссякаемым источником различных полезных для человека веществ.Среди них особое место занимают микроорганизмы, образующие антибиотики, ферменты, аминокислоты, витамины и др. соединения.
Антибиотики — это низкомолекулярные вещества, вырабатываемые микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, преимущественно в стационарной фазе. В промышленных условиях культивирование продуцентов антибиотиков осуществляется в ферментерах.
Основные условия процесса ферментации. Для успешного проведения процесса ферментации и достижения высокого уровня накопления антибиотика помимо использования оптимальной среды, необходимо соблюдать определенные условия ведения процесса:
— поддерживать необходимую температуру;
— соблюдать оптимальное значение рН среды и культуральной жидкости в процессе ферментации;
— обеспечивать культуру достаточным количеством кислорода;
— не допускать интенсивного вспенивания;
— не допускать загрязнения культуры продуцента посторонними микроорганизмами;
Температура
Для биосинтеза каждого антибиотика требуется определенная температура. Так, для биосинтеза пенициллина грибом Репicylliumсhrуsоgепiит оптимальной является температура 25 -26°С, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами обычно поддерживают более высокую температуру — 27-29°С. Однако этот уровень температуры не является наилучшим для биосинтеза всех антибиотиков, которые образуются актиномицетами. При биосинтезе, например, эритромицина культурой Streptomycesеrуthrеus наиболее благоприятной является температура 31—32 °С.В процессе ферментации вследствие интенсивно протекающих процессов выделяется значительное количество тепла. Поэтому для поддержания температуры на желательном уровне необходимо постоянное охлаждение среды.
рН среды
Для биосинтеза большинства известных антибиотиков оптимальное значение рН близко к нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс биосинтеза тормозится. Кроме того, многие антибиотики – целевые продукты ферментации - в щелочных или кислых условиях неустойчивы и быстро инактивируются. Изменение рН среды в процессе ферментации зависит в основном от состава питательной среды и характера процесса метаболизма. Для регулирования рН в питательные среды для получения антибиотиков часто добавляют некоторое количествокальция карбоната. Мел реагирует с образующимися в процессе метаболизма кислотами, образуя нейтральные соли и углекислый газ, который удаляется из среды. Поэтому наличие в среде кальция карбоната предотвращает возможность нежелательного закисления среды.
Аэрация и перемешивание
Все продуценты антибиотиков являются аэробными микроорганизмами и требуют для роста и развития наличия растворенного кислорода. Во время ферментации происходит одновременно два процесса — растворение кислорода в питательной среде и потребление кислорода микроорганизмами.Микроорганизмы используют для дыхания только растворенный в среде кислород, поэтому обеспеченность микроорганизмов кислородом определяется скоростью его растворения в культуральной жидкости.При глубинном культивировании микроорганизмов в промышленных масштабах этот процесс осуществляется путем пропускания воздуха через питательную среду и культуральную жидкость с помощью специальных аэрирующих приспособлений — барботеров. При этом жидкость одновременно интенсивно перемешивается.Основное назначение аэрации и перемешивания — снабжение культуры кислородом, одновременно эти процессы способствуют поддержанию клеток в равномерно взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости.При проведении глубинной ферментации в лабораторных условиях степень аэрации зависит от частоты и интенсивности перемешивания жидкости в колбе.
Вспенивание
Питательные среды, применяемые при получении антибиотиков, содержат вещества, способные образовывать весьма стойкие пены. Аналогичные вещества могут возникать в процессе ферментации.Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента.Борьба с пенообразованием, т. е. пеногашение, осуществляется главным образом путем добавления веществ, способствующих снижению стойкости пены и в дальнейшем ее разрушению. В качестве таких веществ в отечественной промышленности применяют различные жиры ижидкие растительные масла.
Стерильность процесса
Отсутствие посторонней микробиоты при выращивании продуцентов антибиотиков является одним из наиболее важных факторов.Развитие посторонней микробиоты опасно во многих отношениях:
1. Посторонние микроорганизмы, развиваясь в питательной среде, видоизменяют ее и тем самым нарушают оптимальные для биосинтеза антибиотика условия, что приводит к снижению его накопления;
2. Наличие посторонней микробиоты затрудняет дальнейшую обработку культуральной жидкости, отделение ее от клеток (мицелия) и приводит к получению некачественного нативного раствора
3. Продукты жизнедеятельности посторонних микроорганизмов могут загрязнять получаемый антибиотик и снижать его качество
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Работа выполняется в три этапа.
1 Этап. Определение чистоты культурыпродуцента антибиотика на плотной (агаризованной) среде и выбор объектов для инокуляции жидкой Питательной среды и сыпучего субстрата.
Извлеките из термостата свои объекты, приготовленные на занятии №1. Внимательно рассмотрите картину роста микроорганизма на плотной среде в чашке Петри и в пробирке через стекло, НЕ ВСКРЫВАЯ их. Если требуется, сотрите надписи ватным тампоном, смоченным спиртом. Сравните и выявите степень однородности картины.
Если все участки роста в чашке Петри однородны и идентичны таковым в пробирке, чужеродные элементы отсутствуют, то можно сделать вывод об успешном выделении Вами чистой культуры микроорганизма. Выполните инокуляцию культуры в жидкую питательную среду (ПС) и сыпучий субстрат как указано ниже (см. 2 этап).
Описание культуры выполните за пределами асептического блока, после вскрытия чашки Петри и пробирки и осуществления инокуляции.
Если картина роста неоднородна, имеются колонии или участки роста, различающиеся по внешнему виду или инородные вкрапления, отличающиеся по цвету, характеру кромки, высоте, характеру опушения и т.д., то вывод о чистоте выделенной культуры сделать нельзя. Посев в жидкую ПС возможен только после изучения и идентификации всех выявленных объектов роста и выбора подходящего объекта. Выполните препараты «отпечаток» со всех выявленных объектов (см. ниже), строго соблюдая правила асептики и принимая максимальные меры предосторожности для исключения перекрестного загрязнения колоний. Подпишите приготовленные препараты с целью их идентификации. Изучите приготовленные «отпечатки» под микроскопом за пределами асептического блока и, по-возможности, выберите подходящий объект для посева в жидкую ПС. Если подходящие объекты отсутствуют, то работу по выделению чистой культуры продуцента необходимо выполнить повторно с самого начала (см. занятие №1).