Предварительная подготовка (проводится лаборантом).

В два флакона - № 1 «опытный»; № 2 - «контрольный» помещают по 5 мл питательной среды Игла с антибиотиками (100 ЕД пеницилли­на + 50 ЕД стрептомицина) и добавляют в каждый поОД мл гепарини-зированной крови больного. Затем в «опытный» (№ 1) флакон поме­щают 0,1 мл раствора ФГА, а в «контрольный» (№ 2) флакон - ОД мл физиологического раствора.

Флакон закрывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 72 часов.

После указанного срока инкубации культуры центрифугируют и из лейкоцитарной пленки на предметной стекле готовят мазки. Получен­ные мазки (в течение 15 минут) фиксируют в смеси Никифорова), а затем окрашивают по Романовскому.

Работа, выполняемая студентами:

Задача: необходимо провести микроскопический учет результатов ре­акции РБТЛ.

В готовых мазках больного (методику подготовки см. выше) опре­деляют % властных форм лимфоцитов, встречающихся на 100 лимфо­цитов.

Переход лимфоцитов из покоящегося состояния в бластные фор­мы, способные к пролиферации и дифференцировке называется бласт-трансформацией. Данное явление сопровождается морфологическими изменениями лимфоцитов: увеличением их размеров, размеров ядра, количества митохондрий, рибосом, укрупнением лизосом.

Сделайте заключение о состоянии популяции Т-лимфоцитов у больного с СКВ, если известно, что ФГА в норме трансформирует в бласты 70-80% лимфоцитов.

Вопросы по эксперименту

1. Что такое митоген? Виды митогенов?

2. Существуют специфические и неспецифические стимуляторы бла-сттрансформации. Назовите вам известные?

3. Считают, что механизмы антигенной и митогенной стимуляции близки. Попытайтесь их объяснить?

4. Обоснуйте, для больных с какими аллергическими заболеваниями показано проведение РБТЛ, а для каких нет?

5. Какую помощь ожидаете получить от такого лабораторного иссле­дования (РБТЛ) Вы, как будущий врач - в постановке диагноза, уста­новлении ведущего механизма патогенеза, выявлении этиологическо­го фактора?

Задание № 2. Выявление аутоангител (реакция Кумбса) в крови экспериментального животного с гемолитической анемией

Принцип реакции Кумбса заключается в том, что сенсибили­зированные эритроциты, на поверхности которых фиксированы ауто-антитела, агглютинируют при добавлении к ним антиглобулиновой сыворотки, содержащей специфические антитела. Антиглобулиновую сыворотку получают от другого вида животных (чем эксперименталь­ное) иммунизацией их сьшороткои крови или глобулином эксперимен­тального животного.

Различают:

1. прямую реакцию Кумбса - для выявления аутоантитсл, фиксиро­ванных на эритроцитах;

2. непрямую реакцию Кумбса - для выявления аутоакткгел в сыво­ротке крови.

Предварительная подготовка (проводится лаборантами).

В организме экспериментального животного (крыса породы Wistar) моделируют гемолитическую анемию. Гемолитическая анемия вызывается подкожным введением 2,5% раствора солянокислого фе-нилгидразина (из расчета 0,06 мл на 100 г. веса животного) в течение 3-хдней.

Из цельной крови экспериментального животного с фенилгидрази-новой анемией извлекают эритроциты. Эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором. Из «отмытых» таким образом эритроци­тов готовят 5% взвесь.

Подобным же образом готовят 5% взвесь из эритроцитов здоровой крысы (без гемолитической анемии). Данная 5% взвесь эритроцитов будет выступать в качестве контроля (при постановке реакции Кум-бса), а также будет использована в непрямой реакции Кумбса.

Антиглобулиновую сыворотку получают путем иммунизации кро­лика глобулинами крысы.

Экспериментальная работа, выполняемая студентами.

Постановка прямой реакции Кумбса.

1. На предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов кры­сы с экспериментальной гемолитической анемией.

2. Добавляют во взвесь эритроцитов одну каплю антиглобулиновой сыворотки. Образовавшуюся смесь аккуратно перемешивают чистой стеклянной палочкой.

3. Расположив предметное стекло на столике микроскопа отмечают время появления первых агглютинатов. Появление агглютинатов ука­зывает на положительную реакцию. Скорость появления агглютинатов свидетельствует о степени сенсибилизации эритроцитов, т.е. о коли­честве аутоантител на их поверхности:

До 5 минут - реакция резко положительная (+ + +) 5-10 минут - реакция положительная (+ +) 10-15 минут - реакция слабоположительная(+) до 20 минут - реакция сомнительная (+ -).

4. Тоже самое (п. 1-3) проводят с 5% эритроцитарной взвесью здоро­вой крысы (служит контролем).

5. Сравнивают результаты прямой реакции Кумбса у здоровой и больной гемолитической анемией крыс.

Постановка непрямой реакции Кумбса.

1. Берут 5% взвесь эритроцитов здоровой крысы.

2. Из сыворотки крови животного с гемолитической анемией готовят ряд разведений (в физиологическом растворе): 1:2; 1:4; 1:8; 1:16.

3. В каждое разведение (пробирку) добавляют по 0,05 мл 5% взвеси эритроцитов здоровой крысы.

4. Пробирки помещают в термостат (Т=37°С) на 1 час. Считается, что в течение 1 часа антитела из сыворотки крови больного животного ад­сорбируются на эритроцитах здоровой крысы.

5. После часового контакта эритроцитов с сывороткой, эритроциты трижды отмывают в физиологическом растворе.

6. На предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов кры­сы.

7. Добавляют во взвесь эритроцитов одну каплю антиглобулиновой сыворотки. Образовавшуюся смесь аккуратно перемешивают чистой стеклянной палочкой.

8. Расположив предметное стекло на столике микроскопа отмечают время появления первых агглютинатов.

9. Об активности реакции судят по титру разведения сывороток, где появились первые агглютинаты

1:2- сомнительная (+ -)

1:4- слабоположительная(+)

1:8- положительная (+ +)

1:16- резко положительная (+■+ +) ■