Предыстория и предпосылки

Введение

К середине 80-х годов XX века усилиями многочислен­ных исследователей в биологии сложилась достаточно стройная картина системы регуляции клеточного и тканевого метаболизма. Она включает в себя клеточ­ные рецепторы, расположенные на внешней стороне клеточной мембраны, реагирующие на гормоны, цитокины и другие биологически активные агенты. С по­мощью специального внутримембранного белка, вы­полняющего сигнальные функции (белки этого типа относятся к классу так называемых G-белков), сигнал от рецепторов передается на другой белок. Этот белок, расположенный на внутренней стороне клеточной мем­браны, в свою очередь, обеспечивает синтез так назы­ваемых вторичных мессенджеров. Последние и осуще­ствляют регуляцию клеточного метаболизма. Среди вторичных мессенджеров особое внимание исследо­вателей привлекал циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), образующийся из главной энергетической "валюты" биосистем — аденозинтрифосфорной кисло­ты (АТФ) при участии мембраносвязанного белка — аденилатциклазы. Оказалось, что аналог цАМФ — цик­лический гуанозинмонофосфат (цГМФ), возникающий из другого нуклеотида — гуанозинтрифосфорной кисло­ты (ГТФ), также способен влиять на внутриклеточные процессы. Особый интерес вызывало его сосудорасши­ряющее действие, обусловленное высвобождением из гладкой мускулатуры сосудов внутриклеточного каль­ция. Попытки выделить фермент, способный осуще­ствлять превращение ГТФ в цГМФ — гуанилатциклазу (по современной терминологии, гуанилилциклазу) при­вели к неожиданному результату.

Оказалось, что наряду с мембраносвязанной фор­мой этого фермента существует и его водорастворимая форма, достаточно активно продуцирующая цГМФ из ГТФ. Обнаружение этой формы не соответствовало сложившимся к тому времени представлениям о меха­низме синтеза вторичных мессенджеров, предполагав­шего мембраносвязанную природу ферментов, ответ­ственных за образование цГМФ. Предполагалось, что только в этом случае возможна передача регулирующего сигнала на эти ферменты от находящегося в мембране G-белка, который активируется соответствующим ре­цептором. Однако было установлено, что растворимая гуанилилциклаза активируется под влиянием различ­ных водорастворимых соединений без участия соеди­нений, вызывающих активацию клеточных рецепто­ров. Среди них оказались и лекарственные соединения типа органических нитратов и нитропруссида натрия, известные своим сосудорасширяющим (вазодилатирующим) действием. Первое время полагали, что эти ле­карства действуют на гуанилилциклазу как агенты, влияющие на окислительно-восстановительное состо­яние тиоловых групп молекулы гуанилилциклазы. Од­нако сопоставление активации этого фермента, с од­ной стороны, органическими нитратами и особенно нитропруссидом натрия, содержащими соответствен­но нитро- или нитрозогруппы, и, с другой стороны, различными редокс-агентами, окисляющими или вос­станавливающими соответственно тиоловые или ди-сульфидные группы в белках, показало существенно более резко выраженное действие на фермент органи­ческих нитратов и нитропруссида. Этот результат поз­волил группе американских исследователей во главе с Феридом Мьюрэдом в конце 70-х годов предположить, что высокая активность нитро- и нитрозосодержащих сердечнососудистых лекарств обусловлена их способ­ностью продуцировать оксид азота (NO), который и является активатором гуанилилциклазы. Было предпо­ложено, что связывание NO с этой группой приводит к конформационным изменениям гуанилилциклазы, что и вызывает ее активацию. Эксперименты по обработке гуанилилциклазы газообразным оксидом азота полно­стью подтвердили высказанное предположение. Таким образом, впервые было продемонстрировано положи­тельное биологическое действие NO, который раньше рассматривался только как вредный промышленный отход или опасный инициатор синтеза канцерогенных нитрозоаминов в организме животных и человека.

Результаты группы Мьюрэда позволили понять ме­ханизм сердечно-сосудистого действия органических нитратов, и среди них наиболее известного — нитро­глицерина, использовавшегося в медицине уже более сотни лет. Стало ясно, что способность нитроглицери­на купировать сосудистые спазмы обусловлена проду­цированием из него оксида азота. Активация им гаунилилциклазы обеспечивает накопление цГМФ, запуска­ющего цепь биохимических процессов, приводящих к выбросу кальция из гладкомышечных клеток сосудов и тем самым к их расслаблению (вазодилатации). Интересно, что еще в конце 70-х годов XX века Ф. Мьюрэд предположил, что оксид азота как регуля­тор гуанилилциклазы может продуцироваться в орга­низме животных и человека не только из внешних (экзогенных), но и из эндогенных источников. Инымисловами NO может продуцироваться как регулятор жизнедеятельности сердечно-сосудистой системы ес­тественным образом, в ходе метаболических процес­сов. Аналогичное предположение высказывалось в то же время и другим исследователем гуанилилциклазы — ныне покойным немецким ученым Эйком Бёме. Это предвидение блестяще подтвердилось в дальнейшем [1].

Предыстория и предпосылки

Биосинтез NO был открыт в 1987 г. благодаря активации им гуанилатциклазы (ведущая роль этого фермента в расширении кровеносных сосу­дов была известна и ранее), которая осуществля­ется при взаимодействии NO с атомом железа ге­ма с образованием связи Fe-N.

Путь к этому открытию был долог и тернист. Первой заметной вехой была работа П.Митчелла и соавторов 1916 г.: любознательные исследова­тели пытались выяснить, откуда берется нитрат, выводимый с мочой человека и животных. В те годы удобных методов анализа нитрата не суще­ствовало — его определяли взвешиванием в виде КNO₃ (калийной селитры, использовавшейся для получения пороха). Современному химику-ана­литику остается только восхищаться мастерст­вом, трудолюбием и терпением исследователей, которые ежедневно в течение нескольких меся­цев количественно кристаллизовали нитрат из мочи лабораторных животных и собственной, а для сравнения — из образцов еды и напитков, эквивалентных съеденным/выпитым за сутки. Диета экспериментаторов не отличалась однооб­разием или ограниченностью источников про­дуктов - каждодневно анализ нитрата в пище проводили заново. Вывод не вызывал сомнений: человек выделяет нитрата больше, чем потребля­ет с пищей. Иными словами, какие-то соединения азота окисляются в организме в нитрат. Увы, ав­торы слишком опередили время — это замеча­тельное открытие оставалось фактически невос­требованным более 60 лет.

У млекопитающих NO образуется при окисле­нии аргинина — природной аминокислоты, вхо­дящей в состав белков, и расходуется в серии кон­курирующих реакций. Благодаря циклам, возвращающим продукты окисления обратно в NO, его синтез in vivo продолжается даже после полной блокады NO-синтаз (NOC). Интересно, что ингибиторы этих ферментов используются в медицине для защиты от перепроизводства NO, обычного при септическом шоке («заражение крови») и некоторых инфекциях.

Среднее время жизни молекулы NO в организ­ме человека — менее пяти секунд, а для тионитритов (нитрозотиолов, RCNO), в зависи­мости от радикала R, составляет десятки минут и даже часы. По этой причине основная масса ок­сидов азота, вовлеченных в круговорот, прихо­дится не на NO, а на продукты его окисления, ко­торые и образуют депо оксидов азота. У человека и многих млекопитающих восстановление нитра­та в нитрит в обычных условиях малоэффектив­но — основная часть образовавшегося нитрата выводится с мочой.

Таким образом, баланс между реакциями окис­ления NO регулирует количество обращающихся в цикле оксидов азота, а следовательно, и все за­висящие от них физиологические процессы. Ясно, что изучение механизмов сохранения или из­менения этого баланса и активности NО-синтаз (двух путей поддержания пула оксидов азота) — фундаментальная проблема биохимии, имеющая важнейшие практические приложения.

В организме наиболее многочисленны реак­ции оксидов азота, обеспечивающие их участие в регуляции активности белков, а через них и ге­нов. Это реакции нитрования, нитрозилирования (введение остатка нитрозила под действием NO — электрофильная реакция), нитрозирование (введение радикала ·NO — свободно-ради­кальный механизм) с образованием связей С-N, N-N, S-N, О-N.

Быстро обнаружилось, что в молекулу белка вводится сразу несколько NО-групп, а избира­тельность этой модификации никакими разумны­ми схемами объяснить не удавалось. Пока в моле­куле белка два-три свободных остатка цистеина, можно рассматривать гипотезы случайного выбо­ра модифицирующего сайта — по закону лотереи какая-то часть молекул модифицируется правильно. Но если остатков цистеина более 80, а при ак­тивации белка нитрозилируются определенные 20, ни для какой лотереи места не остается — даже единственного выигрыша пришлось бы ждать вечно. А при активации кальциевого канала реа­лизуется именно этот случай [2].