Принцип метода: продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом, состоящим из серной, фосфорной кислот и ванилина, соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.
Реактивы: 1) концентрированная серная кислота по Савалю; 2) концентрированная ортофосфорная кислота; 3) 0,6 % водный раствор ванилина. (0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании смеси на водяной бане. После охлаждения объем доводят до 100 мл. Раствор стабилен, если хранить его при комнатной температуре); 4) фосфорнованилиновая смесь. (4 части концентрированной ортофосфорной кислоты смешивают с одной частью 0,6 % раствора ванилина. Смесь хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре); 5) хлороформ х.ч. или «для наркоза»; 6) основной (12,0 г/л) стандартный раствор триолеина. 1200 мг триолеина растворяют в 100 мл хлороформа. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
Ход работы: опытная проба. К 0,05 мл сыворотки крови прибавляют 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, далее пробирку вынимают и сразу же охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры. Из пробирки отбирают 0,2 мл смеси, которую переносят в другую пробирку, содержащую 3 мл фосфорнованилиновой смеси. После тщательного перемешивания пробы оставляют на 45 мин в темноте при комнатной температуре. Экстинкцию измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (длина волны 500–600 нм) в кювете 0,5 см. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы.
Контрольную пробуставят так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,05 мл воды.
Данные к построению калибровочного графика для определения общих липидов в сыворотке крови
| № пробирок | Основной стандартный раствор триолеина, мл | Хлороформ, мл | Концентрация общих липидов, г/л |
| 0,17 | 0,83 | 2,0 | |
| 0,33 | 0,67 | 4,0 | |
| 0,50 | 0,50 | 6,0 | |
| 0,67 | 0,33 | 8,0 | |
| 0,83 | 0,17 | 10,0 | |
| 1,00 | – | 12,0 |
Обратите внимание! 1. Сыворотку можно хранить в холодильнике в течение 6 дней (не замораживая ее). 2. При концентрации общих липидов выше 12 г/л сыворотку следует развести дистиллированной водой. При расчете учесть разведение. 3. Посуду, применяемую для определения общих липидов, необходимо прополоскать спиртом.
Расчет производят по калибровочному графику или по формуле (норма 4,0–8,0 г/л).
Расчет по калибровочному графику. Из каждого разведения, указанного в таблице, берут по 0,05 мл рабочего стандартного раствора и далее пробы обрабатывают так же, как опытные. Пользуясь полученными данными, строят калибровочный график. Прямая зависимость между содержанием общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 12 г/л.
Расчет по формуле. Общие липиды (г/л) = Еоп/Ест. – Сст., где Е – экстинкция опытных и стандартных проб; С – концентрация основного стандартного раствора (12,0 г/л).
ЛИТЕРАТУРА
Основная:
Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975.
Куксис А. Липиды // Хроматография. Практическое приложение метода// под ред. Э. Хефтмана. М., 1986 Ч. 1. С.130.
Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): учеб. пособие / под ред. М. И. Прохоровой. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982.-272 с.
Практикум по биохимии / под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой. М.: изд-во МГУ, 1989.
Препаративная биохимия липидов / под ред. Л. Д. Бергельсона, Э. В. Дятловицкой. М., 1981.
Прохорова М. И. Большой практикум по углеводному и липидному обмену. / М. И. Прохорова, Э.Н. Тупикова. Изд-во Ленингр. ун-та, 1965.
Чиркин А. А. Практикум по биохимии: учеб. Пособие / А. А. Чиркин. Минск: Новое знание, 2002.
Филиппович Ю. Б. Практикум по общей биохимии / Ю. Б. Филиппович. М.: Просвещение, 1975.
Дополнительная:
Алейникова Т. Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / Т. Л. Алейникова, Г. В. Рубцова, Н. А. Павлова; под ред. Е. С. Северина. М.: изд-во МГУ, 2000.
Биохимия человека / Р. Мари [и др.]. М.: Мир, 1993. 2 т.
Кольман Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рем. М.: Мир, 2000.
Кушманова О. Д. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / О. Д. Кушманова. М.: Медицина, 1983.
Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер. М.: Мир,1985.Т.1
Сенчук В. В. Курс лекций по биохимии / В. В. Сенчук. Минск: БГУ, 2005. Ч. 1. Биомолекулы.
Основы биохимии / под ред. А. А. Анисимова. М.: Высш. шк., 1986.
Программы по биологическим дисциплинам. Минск: БГУ, 2000.
Справочник биохимика / Р. Досон [и др.]. М.: Мир, 1991.
Учебник биохимии и молекулярной биологии / под ред. А. И. Арчакова, А. Е. Медведева, В. П. Скулачева. М.: РАМН, 1999.
Филиппович Ю. Б. Основы биохимии / Ю. Б. Филиппович. М., 1999.
Энкерт Р. Физиология человека / Р. Энкерт, Д. Рэнделл, Дж. Огастин. М.: Мир,1991. 2 т.
www.chem.qmul.ac.uk/iubmb – биологическая классификация и номенклатура. Свободный доступ на сайте Международного союза биохимии и молекулярной биологии.
www.molbiol.ru, www.nature.ru – учебники, научные монографии, обзоры, лабораторные практикумы в свободном доступе на сайте практической молекулярной биологии.
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие ……………………………………………………………3
Основные приемы работы с липидами …………………………….4