VII. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ И МЕТОДЫИХ ВЫДЕЛЕНИЯ
Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.
Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях.
Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств, а также возможности специфично связываться с лигандом.
А. Физико-химические свойства белков
Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду
молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.
Растворимость белков
Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать вьшадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.
Б. Методы выделения и очистки белков
Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:
дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
разделение смеси белков на индивидуальные белки.
Механизм действия детергентов описан в разделе "Денатурация белков При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.
Удаление из раствора небелковых веществ
Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.
ФЕРМЕНТЫ (от лат. fermentum - закваска) (энзимы), белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Осн. ф-ции ферментов- ускорять превращение в-в, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его энергией и др.), а также регулировать биохим. процессы (напр., реализацию ге-нетич. информации), в т. ч. в ответ на изменяющиеся условия.
О механизме р-ций с участием ферментов (ферментативных р-циях) см. Ферментативный катализ, Ферментативных реакций кинетика.
Структуру ферментов изучают методами хим. модификации, рентгеновского структурного анализа, спектроскопии. Ценные результаты получены методом сайт-специфичного мутагенеза, основанного на направленной замене аминокислот в белковой молекуле методами генетической инженерии. К кон. 20 в. известно и охарактеризовано ок. 3000 ферментов.
Классификация ферментов. Исторически многим ферментам присваивались тривиальные названия, часто не связанные с типом катализируемой р-ции. Для преодоления возникших трудностей в сер. 20 в. были разработаны классификации и номенклатура ферментов. По рекомендации Международного биохим. союза, все ферменты в зависимости от типа катализируемой р-ции делят на 6 классов: 1-й - оксидоредуктазы, 2-й - трансферазы, 3-й - гидролазы, 4-й - лиазы, 5-й - изомеразы и 6-й - лигазы. Каждый класс делится на подклассы, в соответствии с природой функц. групп субстратов, подвергающихся хим. превращению. Подклассы, в свою очередь, делятся на подпод-классы в зависимости от типа участвующего в превращении фермента. Каждому достаточно охарактеризованному ферменту присваивается классификационный номер из 4 цифр, обозначающих класс, подкласс, подподкласс и номер самого ферменты Напр., a-химотрипсин имеет номер 3.4.21.1.
К оксидоредуктазам относятся ферменты, катализирующие окислит.-восстановит. р-ции. Ферменты этого типа переносят атомы H или электроны. Многие оксидоредуктазы являются ферментами дыхания и окислительного фосфорилирования.
Трансферазы катализируют перенос функц. групп (CH3, COOH, NH2, CHO и др.) от одной молекулы к другой.
Гидролазы катализируют гидролитич. расщепление связей (пептидной, гликозидной, эфирной, фосфодиэфирной и др·)·
Л и а з ы катализируют негидролитич. отщепление групп от субстрата с образованием двойной связи и обратные р-ции. Эти ферменты могут отщеплять CO2, H2O, NH3 и др.
Изомеразы катализируют образование изомеров субстрата, в т. ч. цис-, транс-изомеризацию, перемещение кратных связей, а также групп атомов внутри молекулы.
Л и г а з ы - ферменты, катализирующие присоединение двух молекул с образованием новых связей (С — С, С — S, С — О, С — N и др.), как правило, сопряженное с расщеплением пирофос-фатной связи, напр. у АТФ.
Особенности строения ферментов. Мол. масса ферментов составляет от 104 до 1010 и более. Чаще всего встречаются ферменты с мол. м. 20-60 тыс., более крупные обычно состоят из неск. одинаковых (гомомеры) или разных (гетеромеры) субьеди-ниц, связанных между собой нековалентными связями. Субъединица может состоять из двух и более цепей, соединенных дисульфидными связями.
В первичной структуре однотипных ферментов, выделенных даже из эволюционно отдаленных организмов, часто наблюдается определенная гомология, а нек-рые участки практически остаются неизменными. Вторичная структура отличается большим разнообразием по содержанию -спиралей и -структур (см. Белки). -Структуры составляют ядро многих ферментов, образуя "опорную" структуру. Совокупность стандартных элементов вторичных структур и специфически уложенных участков полипептидной цепи, определенным образом расположенных в пространстве, образует третичную структуру, определяющую биол. св-ва ферментов.
Третичная структура уникальна для каждого фермента, однако у однотипных ферментов, даже сильно отличающихся по первичной структуре, пространственное расположение цепей м. б. сходным (напр., химотрипсины и субтилизины). Часто в третичной структуре можно выделить отдельные компактные части (домены), соединенные участками полипептидной цепи. Организация в пространстве неск. субъединиц определяет четвертичную структуру ферментов.
На пов-сти белковой глобулы фермента или, чаще, в спец. щели, углублении и т. п. выделяют относительно небольшой участок, наз. активным центром. Он представляет собой совокупность функц. групп аминокислотных остатков, непосредственно взаимодействующих с субстратом. В активный центр фермента, кроме функц. групп, могут входить небелковые составляющие - коферменты. Такой комплекс наз. х о л о -ферментом, а его белковую часть - апоферментом. Аминокислотные остатки, входящие в активный центр, относятся к наиб. консервативным в данной группе ферментов. В активном центре можно выделить субстрат-связывающий участок и собственно каталитически активные группы ферментов. К последним, напр., в подподклассе сериновых протеаз относятся функц. группы остатков серина-195, гистидина-57 и аспарагиновой к-ты-102. Кроме того, в качестве каталитически активных групп ферментов выступают группа SH цистеина, группа COOH глугаминовой к-ты, фенольный гидроксил тирозина и др., а также функц. группы коферментов - никотинамидное кольцо никотинамидных коферментов (см. Ниацин), альдегидная группа (в виде альдимина) пиридоксальфосфата, тиазолино-вое кольцо тиаминпирофосфата, ионы металлов (напр., Zn2+, Co2+, Mn2+) и др.