Ориентировочная карта основ действий
Практического занятия № 7.
Тема: «Основы приготовления простых и сложных питательных сред»
План:
1. Требования, предъявляемые к питательным средам.
2. Основы приготовления питательных сред.
3. Классификация сред и этапы их приготовления.
4. Приготовление простых сред: МПА, МПБ, полужидкого агара, бульона и агара Хоттингера.
5. Приготовление сложных питательных сред:
- сред сахарного ряда,
- кровяного агара,
- сывороточного агара,
- дифференциально-диагностических сред для культивирования энтеробактерий
6. Режимы стерилизации различных сред и контроль качества готовых сред
Самостоятельная работа:
Задание № 1. Ознакомьтесь с инструкцией для проведения практического занятия.
Задание № 2. Изучите требования, предъявляемые к питательным средам.
Основные требования:
1. Питательность - способность содержать основные органогены: С, N, O2, K, Ca, Mq, Cu, Fe;микроэлементы: Mn, Mo, Zn, CI, Na, Ni и др.
2. Достаточная влажность - не менее 20% воды.
3.Изотоничность (концентрация солей в микробной клетке должна соответствовать концентрации солей в среде).Для большинства микроорганизмов - 0,5%.
4.Оптимальная рН. Диапазон 4,5-8,5. Для большинства патогенных микробов=7,2-7,4.
5. Определенный окислительно - восстановительный потенциал. Еh для анаэробов=0,120-0,060 В, для аэробов= более 0,080 В.
Стерильность.
7.Унифицированность - содержание постоянных количеств определенных веществ: аминного азота 0,8- 1,2 г/л, полипептидов, общего азота-2,5-3,0 г/л, хлоридов-0,5%
Задание № 3. Изучите классификацию сред.
Классификация сред
| № | Исходное сырьё | Разновидности | Примеры питательных сред |
| По исходным компонентам | а) натуральные (готовят из продуктов животного и растительного происхождения) б) синтетические (состоят из химических соединений). | МПБ, МПА, кровяной агар Эндо, Левина, Плоскирева | |
| По консистенции | а) жидкие б) плотные | Селенитовый бульон Свёрнутая сыворотка крови, яйца | |
| По составу | а) простые б) сложные | МПБ, МПА, агар Хоттингера Прибавляют к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и т. д. | |
| По назначению | а) основные (служат для культивирования большинства патогенных микробов) б) специальные (для выделения микробов, не растущих на простых средах) в) элективные (благоприятствуют росту одного микроба, но подавляют рост сопутствующих микроорганизмов). Могут выполнять роль, накопительных сред. г) дифференциально-диагностические (позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности) д) консервирующие (предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала) | МПА, МПБ, пептонная вода Для культивирования стрептококка к среде прибавляют сахар, пневмо- и менонго- кокков - кровь, возбудителей коклюша - кровь. Жёлтые кислоты подавляют рост кишечной палочки, но благоприятны для роста возбудителя брюшного тифа. Глицериновая смесь. |
Задание №4. Изучите этапы приготовления питательных сред.
Основные этапы приготовления питательных сред:
1. Изучение инструкции по приготовлению питательной среды.
2. Взятие навески питательной среды и нужного объема дистиллированной воды.
3. Варка.
4.Установление рН.
5. Осветление.
6.Фильтрация.
7.Разлив.
8.Стерилизация.
9. Контроль.
Задание №5. Изучите рецепты приготовления основных сред:
Мясо-пептонный агар (МПА)
38г. порошка размешать в 1 л. дистиллированной воды, довести до кипения, кипятить до полного расплавления агара (1 – 2 мин.). Разлить в стерильные флаконы и стерилизовать автоклавированием в течении 20 мин. при 121°C (1 атм.). Перед разливом в чашки Петри среду охладить до 50°C, разливать слоем 4-6 мм. после застывания среды чашки подсушить в термостате при 37°C.
Мясо-пептонный бульон (МПБ)
15г. порошка тщательно размешать в 1 л. холодной дистиллированной воды. Прокипятить 1-2 мин. Не допуская пригорания. Разлить в пробирки и флаконы. Стерилизовать при 120°C 20 мин.
Полужидкий агар
3,8 г. порошка размешать в 1л. дистиллированной воды, довести до кипения, кипятить до полного расплавления агара (1 – 2 мин.). Разлить в стерильные флаконы или пробирки стерилизовать автоклавированием в течении 20 мин. при 121°C (1 атм.). Среду охладить до 50°C, разлить в пробирки по 5 мл.
Бульон Хоттингера.
Перевар Хоттингера разводят водой в 5-6 раз в зависимости от того, какое количество аминного азота онсодержит и какое его количество должно быть в бульоне (указано в паспорте перевара и рецепте среды).
Например, для приготовления среды с 1,2 г/л аминного азота перевар, содержащий 9,0 г/л, надо развести в 7,5 раз (9,0:1,2).
К разведенному перевару прибавляют 0,5% натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли.
В остывшей среде устанавливают рН, фильтруют, разливают и стерилизуют 20 мин при 120 °С.
Агар Хоттингера.
К 1 литру бульона Хоттингера прибавляют 15-25 г. (1,5-2,5%) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного разведения агара. Устанавливают pH - 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 1200С в течение 20 мин.
Задание №6. Приготовьте питательные среды согласно инструкции.
Задание №7. Изучите рецепты приготовления сложных питательных сред.
Кровяной агар
Расплавить 100 мл. 2% мясопептонного стерильного агара, охладить его до 45°C (не выше!) и прибавить 5 -10 % дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производить, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разлить в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате). Дать среде застыть и подсушить в термостате.
Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
Сывороточный агар
Расплавить 100 мл. 2% мясопептонного стерильного агара, охладить его до 45°C (не выше!) и прибавить 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Добавление сыворотки производить, соблюдая правила стерильности. Тщательно перемешать, избегая образования пены. Разлить в стерильные чашки Петри. Дать среде застыть и подсушить в термостате.
Среды Гисса.
1,5 г. порошка тщательно размешать в колбе с 100 мл. холодной дистиллированной воды, прокипятить 1-2мин., не допуская пригорания, разлить в пробирки по 3-4 мл. Стерилизовать 20 мин. при 110°C (0, 5 атм.) или дробным методом.
Среда Эндо
3,7 4 г. среды размешать в 100 мл. дистиллированной воды, кипятить 2-3 мин. до полного расплавления агара, фильтровать через ватно-марлевый фильтр, снова довести до кипения, охладить до температуры 45-50 °C и разлить в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37 °C в течении 40-60 мин. Готовую питательную среду необходимо использовать в день приготовления.
Среда Плоскирева
6,2 г. среды тщательно размешать в 100 мл. дистиллированной воды, кипятить 2- 3 мин., периодически помешивая, до полного расплавления агара. Охладить до температуры 45-50°C и разлить в нестерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. и оставить для застывания. Перед посевом чашки со средой подсушить на рабочем столе с открытыми крышками в течении 90-100 мин. при температуре 18 – 25 °C.
Среда с эозин – метиленовым синим (среда Левина)-ЭМС.
3,64 г. среды тщательно размешать в 100 мл. дистиллированной воды, кипятить 2-3 мин. до полного расплавления агара, фильтровать через ватно-марлевый фильтр и автоклавировать при температуре 110°C в течении 20 мин. Стерильную среду охладить до температуры 45 - 50°C и разлить в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37 °C в течении 40 – 60 минут.