Эхинохром А улучшает способность переносить физическую нагрузку при кратковременной тренировке на выносливость у крыс
Тэ Юн Сео 1, Робин А. Макгрегор 1, Су Джин Нох 1, Сунг Джун Чой 2, Наталья П. Мищенко 3, Сергей А. Федореев 3, Валентин А. Стоник 3 и Джин Хан 1 *
1. Национальный научно-исследовательская лаборатория по митохондриальной сигнальной системе, кафедра физиологии, Медицинский колледж, Центр сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний, университет Индже, Корея, Пусан, Пусанджин, Бокджи-по 75, 633-165; Эл. почта: sdy925@gmail.com (D.Y.S.);robinmcgregor@gmail.com (Королевская академия музыки); msns6336@hanmail.net (S.J.N.)
2. Кафедра спорта и медицинских наук, Университет Кёнсон, Корея, Пусан 608-736, Нам-гу, Суйонг-по 309; Эл.почта: choisj@ks.ac.kr
3. Джордж Б. Еляков, дальневосточный филиал Тихоокеанского института биоорганической химии в России,
Академический редактор: Пир Б. Джейкобсон
Поступило: 10 июля 2016 / Принято: 31 августа 2016 / Опубликовано: 8 сентября 2016
Аннотация: Эхинохром A (Эхи A) улучшает митохондриальную функцию в сердце; однако, его влияние на скелетные мышцы пока до конца не выяснены. Мы предположили, что действие Эхи-А во время краткосрочного упражнения может улучшить способность переносить физическую нагрузку. Двадцать четыре самца крыс породы Спрег-Доули были в случайном порядке разделены на следующие группы: контрольную группу (КГ), группа, которой ввели Эхи-А (ЭГ), аэробная группа (АГ) и аэробная группа, которой ввели Эхи-А (АЭГ) (n = 6 на группу). Эхи-А вводили внутрибрюшинно (0,1 мг / кг Эхи-А в 300 мкл фосфатно-солевого буферного раствора) ежедневно за 30 минут до каждого упражнения. Группы АГ и АЭГ выполняли упражнения на беговой дорожке (20 м / мин, 60 мин / день) пять дней / неделю в течение двух недель. По сравнению с другими группами переносимость физических нагрузок была значительно выше в группах АГ и АЭГ. Интересным является факт того, что способность к переносимости физических нагрузок наиболее эффективно возросла в группе АЭГ. Масса тела самцов крыс в группе ЭГ, как правило, несколько ниже, чем в других группах. Среди групп не наблюдалось никаких существенных изменений в липидах плазмы. Тем не менее, содержание митохондрии в икроножной мышце было наиболее высоким в группах ЭГ и АЭГ. Эти данные показывают, что введение в организм Эхи-А после кратковременных тренировок на выносливость повышает способность переносить физические нагрузки, что также было связано с увеличением объема митохондрий в скелетных мышцах.
Ключевые слова: аэробные упражнения; Эхинохром A; скелетная мышца; митохондриальная функция
Введение
В последние годы большое количество новых морских лекарственных препаратов с биоактивными свойствами были отождествлены с препаратами, обладающими антибактериальными, антипротозойными, противотуберкулезными, антивирусными, антидиабетическими и противовоспалительными действиями [1]. Морские добавки, содержащие биологически активные соединения, были предложены для ускорения восстановления работоспособного состояния после упражнений или улучшения адаптации к тренировкам [2]. Морские ежи дают уникальный источник морских биоактивных компонентов, которые являются естественными антиоксидантами [3]. В частности, было замечено, что Эхинохром А (Эхи-А), т.е. натуральный пищевой пигмент, полученный из морских ежей, обладает антиоксидантными свойствами и может выступать в качестве металлохелата [4]. Последние результаты исследований показали новый терапевтический потенциал Эхи-А, применение которого направлено на сокращение заболеваний, связанных с ацетилхолином [5]. Кроме того, Эхи-А и подобные гидроксиды нафтазарина, как сообщается, проявляют свой биоактивный эффект при низких дозах с умеренной или низкой токсичностью у мышей в естественных условиях (in vivo) [6]. Наше предыдущее исследование показало, что Эхи-А может активировать транскрипцию генов, ответственных за митохондриальный биогенез в лабораторных условиях (in vitro) [7], и модулирует митохондриальную респирацию в клеточной линии кардиомиобласта (сердечная мышечная клетка) H9c2 и изолированных кардиомиоцитах у крыс [8]. Однако неизвестно, существуют ли подобные механизмы, которые влияют на объем митохондрий или функции скелетных мышц. Эти возможности не были проверены предыдущими исследованиями, хотя увеличение объема митохондрий является важным для функции скелетных мышц и повышает переносимость физической нагрузки.
Регулярные физические упражнения приводят к адаптации на морфологическом и клеточном уровнях, включая увеличенный объем митохондрий в скелетных мышцах и изменение энергетического метаболизма [9]. Хорошо известно, что выносливость является средством прогнозирования заболеваемости и смертности [10]; таким образом, ориентированность на выносливость к физическим нагрузкам является эффективной мерой для улучшения здоровья. В частности увеличение объема митохондрий в скелетных мышцах в результате тренировок играет важнейшую роль в совершенствовании способности к физическим нагрузкам [11, 12]. В настоящее время широко распространен интерес к новым биологически активным препаратам, которые могут поддерживать или, наоборот, улучшать адаптацию к тренировкам, а также повысить выносливость к физическим нагрузкам [13]. Природные морские добавки, которые были получены в последние годы исследований, появились в качестве потенциальных эргогенических средств для подготовки к физическим нагрузкам. Как показали результаты некоторых исследований, введение Эхи-А в повседневный рацион приводит к улучшению митохондриальной функции в сердечных мышцах. Таким образом, мы выдвинули гипотезу о том, что Эхи-А может иметь эргогенический потенциал повышения способности переносить физическую нагрузку в сочетании с краткосрочной подготовкой к физическим упражнениям, которые также могут быть частично опосредованы избытком митохондрий. Кроме того, мы определили, влияет ли введение Эхи-А в сочетании с краткосрочными физическими тренировками на изменение массы тела, мышечной массы и уровня липидов в крови.
Результаты
2.1. Влияние Эхи-А на выносливость к физической нагрузке
Химическая структура Эхи-А, выделенная из морского ежа Скафехинуса Необыкновенного (Saphechinus mirabilis), показана на рисунке 1А. Двух недель тренировок было достаточно, чтобы увеличить расстояние пробега (р <0,001, рис 1B) и общего объема работы (р <0,001, рис 1C), сделанной во время испытания на выносливость при максимальной нагрузке в сравнении с контрольными данными неподготовленной группы. Важно отметить, что применение препарата Эхи-А во время тренировочных упражнений привело к значительному увеличению расстояния пробега при истощении (p < 0.001, рис. 1B) и общий объем работы (p < 0.001, рисунок 1С) был выполнен во время испытания на максимум по сравнению с другими группами. Время пробега значительно возросло после введения Эхи-А во время физических тренировок по сравнению с группами КГ и ЭГ (р <0,05, рис 1Д). Никаких изменений не наблюдалось во времени пробега, расстоянии пробега или общей работе, которая была завершена во время испытания на максимальную выносливость к физической нагрузке после введения препарата Эхи-А в самостоятельно и без подготовки к упражнениям по сравнению с контрольной группой (рис 1B, C).
Рисунок 1. (А). Химический состав Эхи-А; (B) расстояние до истощения; (C) килоджоули работы, выполненной в ходе испытания на максимальную физическую нагрузку; и (Д) Разница во времени до истощения между контрольной группой (КГ), группой, которой был введен Эхи-А (ЭГ), аэробной группы (АГ), и аэробной группой, которой был введен Эхи-А (АЭГ). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (Среднеквадратическое отклонение).* Р <0,05; КГ и ЭГ в сравнении с АЭГ, *** р <0,001; КГ и ЭГ против АГ, ### р <0,001; и все группы в сравнении с АЭГ.
2.2. Влияние Эхи-А на массу тела и массу скелетной и сердечной мышц
Было вычислено соотношение массы камбаловидной и икроножной мышц к массе тела. Введение препарата Эхи-А во время физических упражнений не оказало существенного влияния на массу тела или массу камбаловидной мышцы (рис 2A-Д). Масса тела и масса камбаловидной мышцы были немного ниже у крыс, которым ввели препарат Эхи-А по сравнению с крысами из группы КГ (масса примерно 3%). Соответствующая разница в весе была ниже по сравнению с группами АГ и АЭГ. В противоположность этому, масса икроножной мышцы и масса сердца имели некоторую тенденцию к увеличению в группах, получавших препарат Эхи-А.
Рисунок 2. (А). Разница в массе тела; (B) разница в массе икроножной мышцы; (C) разница в массе камбаловидной мышцы и (Д) массе сердца между контрольной группой (КГ), группой, которой ввели Эхи-А (ЭГ), аэробной группой (АГ) и с группой, которой ввели Эхи-А (АЭГ). Данные выражены в виде среднего значения ± СО.
2.3. Влияние Эхи-А на липиды в плазме
Во время физических нагрузок под действием препарата Эхи-А никаких существенных изменений в липидах плазмы не наблюдалось. Вместе с тем, упражнения, выполненные самостоятельно, также не повлияли на изменение липидов в плазме (таблица 1).
Таблица 1. Биохимические характеристики экспериментальных групп
| КГ | АГ | ЭГ | АЭГ | |
| ОХ (мг/дл) * ТГ (мг/дл) ХЛНП (мг/дл) ХЛВП (мг/дл) | 66.00 ± 9.53 1 75.66 ± 26.66 23.66 ± 10.17 40.33 ± 8.41 | 56.66 ± 3.51 43.66 ± 3.84 11.00 ± 1.15 36.00 ± 3.21 | 56.66 ± 6.35 120.00 ± 51.17 14.00 ± 6.08 43.00 ± 4.93 | 48.66 ± 4.25 113.33 ± 32.77 9.33 ± 2.40 37.33 ± 5.36 |
| Значения являются средними ± СО (SE). КГ – контрольная группа; ЭГ – группа, которой ввели Эхи-А; АГ – аэробная группа; АЭГ – аэробная группа, которой ввели Эхи-А. * мг/дл – миллиграмм на децилитр. ОХ – общий холестерин. ТГ – триэфир глицерина. ХЛНП – холестерин липопротеинов низкой плотности. ХЛВП – холестерин липопротеинов высокой плотности. |
2.4. Влияние Эхи-А на митохондрии в скелетных мышцах
Мы также рассмотрели, оказывает ли влияние введение препарата Эхи-А во время тренировочных упражнений на избыток митохондрий в икроножных мышцах, используя при этом электронную микроскопию высокого разрешения на разных этапах увеличения масштаба. Мы наблюдали большой избыток митохондрий в икроножных мышцах грызунов под действием препарата Эхи-А, с (p < 0,05) или без физической подготовки (p < 0,05), по сравнению с "чистыми" грызунами без физических нагрузок, которым препарат введен не был (рис. 3A).
Рисунок 3. (A). Разница в скелетных мышечных митохондриях грызунов, основанная на изображении трансмиссионного электронного микроскопа среди групп.
Объем митохондрий (В) был ярко выражен как объем митохондрий / участка. Контрольная группа (КГ), группа, получившая препарат Эхи-А (ЭГ), аэробная группа (АГ), и аэробная группа, получившая препарат Эхи-А (АЭГ). Р <0,05; КГ против ЭГ, # р <0,05; КГ против АЭГ. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (SE).
Обсуждение
Основные результаты исследования показали, что введение Эхи-А во время тренировок привело к значительному улучшению переносимости физической нагрузки по сравнению со всеми другими группами, что сопровождалось значительным увеличением содержания митохондрий. Тем не менее, введение только препарата Эхи-А без каких-либо тренировок не увеличило выносливость к физическим нагрузкам, однако увеличило содержание митохондрий. Важно, что нам удалось продемонстрировать, что действие препарата Эхи-А привело к увеличению числа митохондрий в скелетных мышцах, однако именно действие препарата во время тренировок увеличило способность переносить физические нагрузки.
Способность переносить физические нагрузки является жестко контролируемым процессом, в котором энергия, поступающая с дыханием, обеспеченная работой митохондрий, уравновешивается затратами энергии. Общепризнано, что физическая подготовка приводит к широкому распространению морфологических изменений и адаптации в клеточных процессах, которые имеют непосредственное отношение к содержанию и функциям митохондрий. В настоящем исследовании мы показали, что объем митохондрий у адаптированных к физическим тренировкам грызунов было больше, чем у неподготовленных особей. Несколько основополагающих механизмов могут объяснить индуцированное препаратом Эхи-А улучшение в переносимости физической нагрузки во время краткосрочного тренинга, в том числе изменение митохондрий или антиоксидантной способности в скелетных мышцах. Ранее эксперименты, проведенные в лабораторных условиях (in vitro), показали, что Эхи-А может активировать транскрипцию генов, ответственных за митохондриальный биогенез [7] и модулировать митохондриальную респирацию в сердечной мышечной клетке H9c2 и изолированных кардиомиоцитах у крыс [8]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, способен ли препарат Эхи-А прямо или косвенно модулировать митохондриальную функцию в скелетных мышцах в естественных условиях (in vivo). Препарат Эхи-А способен также потенциально модулировать антиоксидантную активность в скелетных мышцах. Физические упражнения приводят к увеличению свободных радикалов, которые могут вызвать повреждение клеток; тем не менее, повышение антиоксидантной активности способствует удалению свободных радикалов в клеточной линии сердца в лабораторных условиях (in vitro). Это говорит о том, что если препарат Эхи-А обладает антиоксидантной активностью [5], то он также способен снизить суточное накопление свободных радикалов и окислительного стресса, вызванного физической нагрузкой, что, в свою очередь, может улучшить восстановление работоспособного состояния. Однако необходимы дальнейшие исследования скелетных мышц, чтобы определить, является ли действие препарата Эхи-А причиной увеличения способности переносить физическую нагрузку или, может быть, причиной изменений в антиоксидантной активности.
Хорошо известно, что физические упражнения могут уменьшить жировые отложения в теле и увеличит массу сердца и скелетные мышцы. В настоящем исследовании имели тенденцию тормозить набор веса тела в группах АГ и АЭГ по сравнению с КГ. Интересно, что набор веса был ниже в группе ЭГ по сравнению с другими группами, хотя разница была не значительной (см. рис. 2А). Настоящее исследование является первым, направленным на изучение возможности Эхи-А снижать вес тела и увеличивать массу сердца и икроножной мышцы. Однако последующие исследования более долгие по протяженности важно выполнить для определения пролонгированного воздействия препарата Эхи-А на сокращение набора веса под физическими нагрузками или без них, в частности у животных образцов с диетообусловленным ожирением.
Мы признаем, что данные результаты являются предварительными и что настоящее обследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, мы использовали кратковременные физические нагрузки, которые могли быть ограничены эффективным размером между группами с учетом главных параметров, включая выносливость к нагрузками и содержание митохондрий в скелетных мышцах. Во-вторых, более механизированные последующие исследования необходимы для определения механизма, основанного на положительном эффекте введения Эхи-А во время физических нагрузок на выносливость, к примеру, изменения в митохондриальной оксидативной фосфориляции, производстве АТП и анти-оксидантной активности. Наконец, в настоящем исследовании мы использовали здоровых грызунов, и, тем не менее, дальнейшие исследования требуют определения, может ли Эхи-А увеличить выносливость у грызунов с хроническими заболеваниями, при которых выносливость ограничена, как на пример в случаях восстановления после растяжения или состояния после инфаркта миокарда [14, 15].
Экспериментальная секция
4.1 Структура эксперимента
Мужские особи крыс Sprague-Dawley (возраст: 8 недель, n = 24) были закуплены в Восточной биолаборатории животных (Теджён, Южная Корея), содержались в контролируемых условиях лаборатории (12:12 часов цикл освещения/темноты, 220С) и обеспечивались водой и питанием ad libitum. Крысы случайным образом были разделены на контрольную группу (КГ, n=6), группа, которой ввели Эхи-А (ЭГ, n=6), аэробная группа (АГ, n=6) и аэробная группа, которой ввели Эхи-А (АЭГ, n=6). Все процедуры были выполнены в соответсвтии с Требованиями Комиссии по этике при проведении экспериментов на животных медицинского университета Индже.
4.2 Введение Эхи-А и обеспечение физических нагрузок
Эхи-А был получен из Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, Владивосток, Россия. Субстанция была растворена в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) за 30 минут до каждой сессии физической нагрузки. Животным из ЭГ и АЭГ групп делались инъекции интраперитонеально в количестве 0,1 мг/кг 300 мкл фосфатно-солевого буферного раствора. Животным из групп КГ и АГ вводился 1, мл фосфатно-солевого буферного раствора интраперитонеально. Физические нагрузки выполнялись на беговой дорожке (20 м/мин, 60 мин/день, 5 дней /неделю) в течение 2 недель. Для подтверждения постоянной интенсивности физической нагрузки беговая дорожка оборудована планками электрошока. Во избежание потенциального стресса, которому подвергнутся животные до эксперимента, их подвергли адаптационному периоду для ознакомления животных с беговой дорожкой.
4.3 Вес органов и биохимические измерения
После двух недель с начала физических тренировок, кровь из сердца была собрана в гепаринизированную пробирку. Животные были умерщвлены инъекцией пентобарбитала натрия (1 мг/кг) с гепарином (300МЕ/мл/кг). Вес тела измерялся ежедневно утром перед тренировками. Камбаловидная и икроножная мышцы были немедленно удалены и взвешены. Соотношение веса камбаловидной и икроножной мышц к весу тела был рассчитан. Липиды плазмы были измерены, как описано выше [17].
4.4 Тест на выносливость
Для того, чтобы определить эффективность Эхи-А в увеличении выносливости, все группы подверглись жесткому тесту с инкрементными упражнениями на беговой дорожке в течение последней недели. Жесткий тест с инкрементными упражнениями на беговой дорожке, установленной с градиентом 150, который начинается на скорости 10 м/мин в течение 5 минут с увеличением скорости на 2 м/мин каждые 2 минуты до истощения. Тест прерывался, когда крысы останавливали бег и оказывались на полоске электрошока [18]. Общая работа рассчитывалась следующим образом: общая выполненная работа = сила * расстояние [19].
4.5 Трансмиссионная электронная микроскопия
Ткани икроножной мышцы были срезаны маленькими секциями (1 мм3) и обработаны 2,5% глутаральдегидом в 100 мМ фосфатном буфере при температуре 40С 2 часа. После чего секции были отмыты в фосфатном буфере и сохранены при 40С или окрашены, как описано ниже. Ткань мускулов была впоследствии фиксирована в эпоксидной смоле (Ардалит CY2012, высококлассный агар, технология электрон, Станстид, Великобритания). После этого, 750нм сагиттальных секций были разрезаны и окрашены толуидиновым синим для светового микроскопического анализа. Окрашенные секции были осмотрены под микроскопом Leica DM 6400 (Лейка Микросистемс (Leica Microsystems), Ветзлар, Германия). Для электромикроскопического анализа ультратин 60-70 нм секции были разрезаны с использованием ультрамикротома (LKB Nova, Бромма, Швеция), окрашенные на медных гранулах с размером ячеек 200 (высококлассный агар, технология электрон, Станстид, Великобритания), а затем окрашены уранилацетатом и цитратом свинца Рейнольда. Гранулы были визуализированы трансмиссионным электронным микроскопом JEOL 100SX (ДЖЕОЛ Лтд. (JEOL Ltd.,), Акишима, Токио, Япония), изображения были собраны с помощью фотографической пленки (Кодак 4489, Эстман Кодак Компани, Рочестер, Нью-Йорк, США) [20]. Митохондриальное содержание было определено по изображениям с увеличением 10 000 с использованием программного обеспечения Имэйдж Дж (Image J) (Версия 1,48. НИХ, Бетесда, Мэриленд, США) и рассчитаны как подсчет митохондрий/µм2. Данные показали митохондриальное содержание 8 микрографических/ экспериментальных групп / на животное.
4.6 Статистический анализ
Данные представлены как значения ± стандартная погрешность. Для статистического анализа мы использовали односторонний анализ дисперсии (ANOVA) c турецким post hoc тестом. Статистическая значимость наблюдалась при значении p<0,05
Выводы
В заключение можно сказать, что это первое исследование, которое было проведено, чтобы показать, что ежедневное внутрибрюшинное введение препарата Эхи-А во время краткосрочной тренировки на выносливость в течение двух недель улучшило выносливость к физическим нагрузкам по сравнению с контрольными грызунами, обработанными препаратом. Благотворное воздействие Эхи-А может также быть отчасти из-за улучшенной адаптации к дополнительному обучению, в том числе и из-за повышения содержания митохондрий в скелетных мышцах. Однако необходимы дальнейшие исследования механизма действия данного препарата.
Благодарности
Министерство образования, науки и техники Кореи (2010-0020224) оказало неоценимую поддержку проведению данной работы.
Авторский вклад
Тэ Юн Сео, Робин А. Макгрегор, Су Джин Нох, Сунг Джун Чой провели эксперименты, испытания и анализ данных. Наталья П. Мищенко, Сергей А. Федореев, Валентин А. Стоник очистили пигмент Эхинохром А.
Дэ Юн Сео, Робин А. Макгрегор, Сунг Джун Чой, Наталья П. Мищенко, Сергей. А. Федореев, Валентин А. Стоник и Джин Хан резюмировали данную работу и записали рукописный документ.
Конфликт интересов
Авторы заявили, что никаких конфликтов интересов у них не имеется.