О. Ю. Кремнева, И. Л. Астапчук, Г. В. Волкова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНА НЕКРОЗА ТОХ А В ПОПУЛЯЦИИ PYRENOPHORA TRITICI-REPENTIS КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ
Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение
«Всероссийский научно-исследовательский институт
биологической защиты растений»
С использованием фитопатологического и молекулярного методов проведено изучение основного фактора патогенности P. tritici-repentis – токсина, индуцирующего образование некроза листьев пшеницы, в выборке изолятов гриба из пяти районов Краснодарского края. В результате фитопатологического теста выявлено, что 77,7 % изолятов вызывали некроз на сорте Glenlea, индуцируя токсин Ptr ToxA. ПЦР- диагностика выявила ген ТохА у 83,3 % изолятов возбудителя болезни. Полученные результаты свидетельствуют о том, что генетическая природа некроза, вызываемого изолятами гриба, может быть различной.
Ключевые слова: желтая пятнистость листьев, pyrenophora tritici-repentis, токсин Ptr ToxA, ген ToxA, некроз, пшеница.
Введение.
Желтая пятнистость листьев пшеницы - заболевание вызываемое грибом Pyrenophora tritici-repentis (несовершенная фаза: Drechslera tritici-repentis), распространено во всем мире, где выращивается пшеница и другие восприимчивые к данному патогену культуры [1-3]. Заболевание развивается на пшенице в весенне-летний период на верхних и нижних листьях. Гриб также может заражать колосовые чешуи и в итоге зерно, вызывая заболевание семян, известное как красное пятно. В последнее время отмечено нарастание развития и распространения желтой пятнистости листьев пшеницы во всем мире. Предпосылкой такой ситуации стало выращивание культуры на одном поле из года в год и сохранения практики поверхностной (минимальной) обработки почвы, в результате которой растительные остатки остаются на поверхности почвы, тем самым приумножая инфекцию. Так же широкому распространению заболевания способствовало возделывание и районирование устойчивых к ржавчинным заболеваниям сортов пшеницы и восприимчивых к P. tritici-repentis, что создало благоприятные условия для накопления инокулюма в природе и, как результат, возрастание численности популяции патогена.
Существует два качественных типов симптомов желтой пятнистости листьев пшеницы: некрозы и хлорозы. Симптом некроза включает пятна, которые появляются сначала в качестве темно-коричневого пятна, которое разрастается, принимая линзообразную форму, часто окружено желтым ореолом. Симптом хлороза - хлоротичные пятна, являются результатом постепенного пожелтения ткани. Поражения могут сливаться в большие пятна, и это приводит к преждевременному старению листьев. Основываясь на этих двух типах симптомов, в настоящее время, изоляты P. tritici-repentis разделены на 8 рас, которые сгруппированы в соответствии с их реакцией: вирулентность / авирулентность на наборе сортов/линий, используемых в качестве дифференциаторов [3-7].
Специфическое взаимодействие между растением-хозяином и P. tritici-repentis обусловлено способностью изолятов патогена вызывать на специфических линиях и сортах пшеницы различные симптомы, независимо от их генотипов. В настоящее время четыре-специфичных токсинов имеют свою характеристику: токсин Ptr Tox А индуцирует некроз; токсины Ptr Tox B и Ptr Tox C – хлорозы, но на разных линиях пшеницы; токсин Ptr ToxD некроз и хлороз одновременно [8-9]. Основным фактором патогенности считается токсин Ptr Тох А, вызывающий некрозы на листьях восприимчивых сортов пшеницы [4,9-10].
Одним из методов биологической защиты растений от болезней является создание и возделывание устойчивых сортов. Такая стратегия защиты должна основываться на сведениях о популяционной структуре патогена: вирулентности, фенотипическом и расовом составе, изменчивости.
Целью данного исследования являлось определение расовой принадлежности изолятов Р. tritici-repentis северокавказского региона и токсина Ptr ТохАфитопатологическим тестированием и гена некроза ТохА, используя метод ПЦР.
Материалы и методы.
Материалом исследований служили 18 моноконидиальных изолятов P. tritici-repentis, выделенных с пораженных образцов пшеницы, собранных с полей Краснодарского края: Динского, Ейского, Лабинского, Крыловского, Щербиновского районов.
Способность изолятов гриба продуцировать токсины определяли фитопатологическим методом на канадском наборе дифференциаторов: сорте Glenlea (Ptr ToxA) и линиях 6B365 (Ptr ToxC) и 6В662 (PtrToxB) (таблица 1).
Таблица 1
Характеристика рас P. tritici-repentis по способности
образовывать экзотоксины [7]
| Расы | Сорта дифференциаторы | ||
| Glenlea | 6B662 | 6B365 | |
| N (ToxA) | R | C (ToxC) | |
| N (ToxA) | R | R | |
| R | R | C (ToxC) | |
| R | R | R | |
| R | C (ToxB) | R | |
| R | C (ToxB) | C (ToxC) | |
| N (ToxA) | C (ToxB) | R | |
| N (ToxA) | C (ToxB) | C (ToxC) |
Примечание:
N (ToxA) – Индуцирует фактор болезни Ptr ToxA, вызывающий некроз на Glenlea
C (ToxB) - Индуцирует фактор болезни Ptr ToxВ, вызывающий хлороз на 6B662
C (ToxС) - Индуцирует фактор болезни Ptr ToxС, вызывающий хлороз на 6B365
R – устойчивая реакция к токсинам P. tritici-repentis
Расовую принадлежность изучали в условиях теплицы. При проведении опытов растения пшеницы выращивали в 25 мл вазонах, набитых песком, на гидропонике с применением питательного раствора Кнопа до фазы двух листьев [2]. Перед инокуляцией с растений снимали восковой налет. Для приготовления конидиальной суспензии использовали 8-суточную споросодержащую культуру гриба. Фильтрацию осуществляли через 2-3 слоя стерильной марли. Титр спор готовой суспензии определяли подсчетом количества конидий в капле известного объема с применением камеры Горяева.
Инокулированные растения выдерживали во влажной камере в течение 11-12 ч при температуре 20 оС. Учет степени развития заболевания проводили на 8 сутки по шкале Rees [11], таблица 2. Согласно этой шкале сорта с проявлением болезни 1, 2 балла относили к устойчивым (R), с типом реакции 3-5 балла – к восприимчивым (S).
Вид гриба идентифицировали по морфологическим признакам конидий, которая описывается, как «имеющая форму змеиной головы» (рисунок 1).
Рисунок 1 – Конидии p. tritici-repentis.
Увеличение: окуляр 10, объектив 40; без окрашивания.
Таблица 2
Шкала оценки устойчивости сортов пшеницы к возбудителю желтой пятнистости листьев в фазу всходов [11]
| Симптомы поражения | Тип реакции, балл | Фенотип пшеницы |
| Симптомы отсутствуют | HR | |
| Мелкие (до 0,5 мм) темно-коричневые пятна. Хлорозов нет или они небольшие | R | |
| Темно-коричневые пятна до 1 мм. Могут быть хлорозы. | MR | |
| Мелкие пятна (1- 2 мм) от бледных до темно-коричневых, часто в желтом ореоле | MS | |
| Большие (3 мм) коричневые пятна, обычно с темно-коричневым центром. В основном окружены значительными хлорозами от 2 до 3 мм. | S | |
| Большие (3-5 мм) некрозы с темно-коричневым центром, сильное пожелтение окружающих тканей. Пятна соединяются, что приводит к гибели части или всего листа. | HS | |
| Примечани: HR – высокая устойчивость, R - устойчивость, MR - средняя устойчивость, MS – средняя чувствительность, S – чувствительность, HS – высокая чувствительность. |
Выделение ДНК моноконидиальных изолятов P. tritici-repentis проводили по модифицированной методике Чена [12]. Амплификацию геномной ДНК проводили в 25 мл реакционной смеси (67 мМ Трис-HCl рН 8,8; 3мМ MgCl2; по 200 мкМ каждого dNTP; 10 рМ/мл праймера; 25 (от 2 до 50) нг геномной ДНК и 0,5 ед. л Taq-полимеразы).
Амплифицированные фрагменты разделяли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, в 0,5 % ТВЕ буфере, гель окрашивали бромистым этидием при напряженности 105 V в течение 2 часов и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Для оценки размера фрагментов использовали 100 bp маркер от Gene Ruler. Полученные электрофореграммы фотографировали и обрабатывали на компьютере.
Анализ проводили с использованием праймеров представленных в таблице 3. Для контроля ДНК на способность к амплификации использовали праймеры CHS-79F и CHS-354R на ген «домашнего хозяйства» хитин-синтазы CHS-1, дающие в ПЦР продукты амплификации размером 275 п.н.
Таблица 3
Праймеры для ПЦР
| Искомый локус | Праймер | Последовательность 5’-3’ | Источник |
| Тох А | ТА51F | GCGTTCTATCCTCGTACTTC | [13] |
| TA52R | GCATTCTCCAATTTTCACG | ||
| Тох А | TA1011F | TGGGCATCATTGCATGGAC | [14] |
| TA1011R | GTGCTTGCTCGCTAATTTTCT | ||
| хитин-синтаза CHS-1 | CHS-79F | TGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG | [13] |
| CHS-354R | TGGAAGAACCATCTGTGAG AGTTG |
Результаты и обсуждение.
С помощью канадского набора сортов-дифференциаторов 18 моноконидиальных изолята P. tritici-repentis были отнесены к определенным расам и определены токсины, которые они продуцируют (таблица 4).
В результате анализа полученных данных выявлено, что 14 изолятов (77,7 % от числа изученных) продуцировали токсин Ptr ToxA, т.е. вызывали некроз на сорте Glenlea.
Для подтверждения индукции токсина Ptr ТoxA в изучаемой выборке изолятов P. tritici-repentis была проведена ПЦР-диагностика гена ToxA с использованием специфичных праймеров: TA51F /TA52R, дающих продукт амплификации 573 п.н. и TA1011F/ TA1011R, дающих продукт амплификации 1011 п.н.
Таблица 4
Определение рас и токсинов P. tritici-repentis
| № изолята | Реакция сортов - тестеров на инокуляцию P. tritici-repentis | № расы | Количество вырабатываемых токсинов | ||
| Glenlea | 6В662 | 6В365 | |||
| изоляты центральной зоны | |||||
| А | В | А | 1 (Тох В) | ||
| В | В | В | 3 (Тох А,В,С) | ||
| В | В | В | 3 (Тох А,В,С) | ||
| В | А | В | 2 (Тох А,С) | ||
| В | В | В | 3 (Тох А,В,С) | ||
| В | А | В | 2 (Тох А,С) | ||
| В | В | В | 3 (Тох А,В,С) | ||
| В | А | В | 2 (Тох А,С) | ||
| В | А | А | 1 (Тох А) | ||
| В | В | В | 3 (Тох А,В,С) | ||
| В | А | В | 2 (Тох А,С) | ||
| А | А | А | |||
| В | А | В | 2 (Тох А,С) | ||
| А | В | А | 1 (Тох В) | ||
| В | А | А | 1 (Тох А) | ||
| В | В | В | |||
| В | В | В | 3 (Тох А,В,С) | ||
| В | А | В | 2 (Тох А,С) | ||
| Примечание: А - устойчивая реакция сорта на заражение P. tritici-repentis (тип реакции 1,2 балла), В – восприимчивая реакция сорта (тип реакции 3,4,5 баллов). |
На рисунке 2 показаны продукты амплификации изолятов патогена, несущие ген ТохА (№ 5-6) и не содержащие его (№1-4). Номера 1, 3, 5, 7 соответствуют изоляту № 1, а номера 2, 4, 6, 8 соответствуют изоляту № 3, представленным в таблице 4. Продукты амплификации гена ToxA обнаружены у большинства (83,3 %) изолятов изучаемой выборки возбудителя заболевания.
1 2 3 4 М 5 6 7 8
Рисунок 2 – Идентификация гена ТoxA у изолятов P. tritici-repentis с использованием молекулярных маркеров
№ 1, 2, 5, 6 - результаты амплификации ДНК изолятов P. tritici-repentis с праймером TA 1011 (определение Тox A)
№ 3, 4,7, 8 - результаты амплификации ДНК изолятов P. tritici-repentis с праймером TA 51/52 (определение Тox A)
М – ДНК маркер (100 bp Plus DNALadder)
При сравнении результатов ПЦР-тестирования с фитотестом, обнаружили, что изолят P. tritici-repentis № 1 не продуцирует токсин Ptr Тох А по фенотипическому проявлению (5 раса не вызывает некроз на восприимчивом сорте Glenleа) и молекулярные исследования не выявили у него гена ТохА. Изоляты № 3 и 15, по своему фенотипу отнесены к 8 и 2 расе, соответственно, индуцируют токсин Ptr Тох А и вызывают некроз на восприимчивом сорте Glenleа, но ПЦР – тестирование показало отсутствие гена Tox A. Изоляты №12,14 и 16 не вызывали некроза на сорте Glenleа, но имели, согласно ПЦР диагностике, ген ToxA. Остальные изоляты имели одинаковую характеристику по наличию или отсутствию ТохА, полученную двумя методами.
Представленные результаты подтверждает данные, описанные ранее рядом исследователей [8, 13-15]. Авторы так же обнаружили, что существуют изоляты гриба, вызывающие некроз, но не несущие ген ToxA и изоляты, у которых ген ТохА не был обнаружен, но они были способны вызывать некроз на листьях сорта Glenlea.
Заключение.
Таким образом, с использованием фитопатологического и молекулярного методов нами было проведено изучение основного фактора патогенности P. tritici-repentis – токсина, индуцирующего образование некроза листьев пшеницы, в выборке изолятов гриба из пяти районов Краснодарского края. Полученные результаты на основе двух методов свидетельствуют о том, что генетическая природа некроза, вызываемого изолятами гриба, может быть различной. Возможно, что изоляты, продуцируют какой-то другой (один или более) токсин, отличный от известного Ptr ToxA, который вызывает некроз листьев пшеницы. Данные результаты демонстрируют необходимость дальнейшего изучения и понимания природы нового фактора патогенности – индуктора некроза, отличного от Ptr ToxA.
.