Технология редактирования генома CRISPR/Cas9.
CRISPR/Cas9 — это сравнительно новая технология редактирования геномов высших организмов, основанная на иммунной системе наоборот самых простейших организмов - бактерий. Данная технология способна изменить наше отношение к огромному множеству повсеместно распространённых наследственных заболеваний. Если раньше они были неизлечимы, то сегодня становится возможным устранять непосредственно саму причину возникновения болезни.
С появлением и развитием технологии редактирования генома появляется также возможность и его «улучшения», изменения в собственных интересах. Например, целью редактирования могут являться не только гены, связанные с наследственными заболеваниями, но и гены, имеющие отношение к повышенному риску для здоровья или отвечающие за успехи в спорте, способность быть не восприимчивым к наиболее распространённым аллергенам: растительной пыльце, пыли, шерсти животных, лактозе…
I. ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ О CRISPR/Cas9 ТЕХНОЛОГИИ.
В основе этой системы — участки ДНК бактерий - CRISPR (короткие палиндромные кластерные повторы). В оригинале: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Эти участки имеются почти у всех архей и большей части бактерий. Они могут находиться как непосредственно на хромосоме, что бывает чаще всего, так и в составе фагов (вирусов бактерий), что встречается уже реже. Данные системы (CRISPR – Cas) состоят из двух основных частей: CRISPR-кассеты и прилегающего к ней кластера генов Сas. Кассета — это блок взаимокомплементарных последовательностей, т.е. повторов длиной от 24 до 48 нуклеотидов. Эти повторы содержат в себе так называемые спейсеры — уникальные вставки примерно такой же длины, что и повторы. Спейсеры идентичны различным участкам фагов и других элементов, когда-либо проникавших в эту клетку или клетки ее предков. Таким образом, CRISPR можно считать неким архивом, альбомом, бережно хранящим информацию, разделенную повторами, о вредителях и просто любых «посетителях», когда-либо нарушавших границу данной клетки. И чтобы противостоять новой интервенции, данный архив должен находиться в мобильном состоянии и постоянно обновляться.
В начале XXI столетия были сравнены последовательности известных CRISPR-спейсеров с последовательностями ДНК. Оказалось, что довольно часто последовательности спейсеров были очень похожи на последовательности вирусов. Что в свою очередь позволило предположить, что CRISPR-кассеты могут нести защитную функцию. В то же время были обнаружены Cas-гены, зачастую располагавшиеся в непосредственной близости с CRISPR-кассетами. И тогда, на основе полученных данных, у учёных сложилась модель, согласно которой, при попадании вируса в клетку он бы обнаруживался с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. И если какой-нибудь из фрагментов генома вируса совпадал с записанным в спейсере, то Cas «разрезает» вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате которых вся ДНК бы уничтожалась.
II. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ CRISPR/Cas9.
Если в стандартных системах, не содержащих белок, получивший название Cas9, несколько белков собираются в сложный комплекс, связывающий CRISPR РНК, а затем данный комплекс распознает вирусную ДНК-мишень (участок ДНК, который нужно редактировать) и привлекает еще один белок, уже непосредственно разрезающий вирусную ДНК, то в системах, содержащих Cas9, последний белок выполняет сразу все эти функции: и связывает CRISPR РНК, и узнает мишень, и разрезает ее. Такой инструмент крайне удобен и прост в применении, относительно стандартных систем.
В природе CRISPR РНК сначала кодируется в CRISPR-кассете, затем связывается белками и лишь потом распознает мишень. Оказалось, что можно получать также и неприродную CRISPR РНК с помощью химического или ферментативного синтеза. При этом место спейсера в такой РНК занимает последовательность, выбранная самим исследователем. Таким образом, белок Cas9, способный распознавать и связываться с такой синтетической, неприродной СRISPR РНК, становится запрограммированным на распознавание и «разрезание» соответствующего ей места в ДНК.
III. МЕХАНИЗМ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ПРИ ПОМОЩИ CRISPR/Cas9.
Большинство клеток человеческого организма, за исключением гамет, диплоидны, то есть, мы имеем двойной набор хромосом — по одному от каждого из родителей. Если в одной из родительских хромосом нарушена, изменена последовательность ДНК в каком-то важном гене, то в таком случае может возникнуть состояние носительства генетической болезни. В случае если обе копии имеют нарушения, отклонения от нормы, — возникнет генетическая болезнь. Классический пример — гемофилия. Для того чтобы вылечить генетическую болезнь, нужно исправить генетическую информацию, изменённую мутацией. Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только лишь одной буквы ДНК, а всего в нашем геноме около 6 миллиардов букв. И чтобы справиться со сложившейся проблемой мы должны найти именно ту единственную ошибку и попытаться исправить ее в заданном месте, не изменяя ничего больше, чтобы не спровоцировать другие болезни. Это и является одной из главных задач геномной медицины. И чтобы исправить изменённый мутацией ген, нам нужен очень точный молекулярный «нож», который найдет мутировавшую последовательность нуклеотидов и сможет, вырезав, удалить её из ДНК. Таким «ножом» и является Cas9. С помощью гида РНК (вирусной CRISPR РНК), последовательность которой совпадает с искомым местом, нужным для удаления, изменения, он может внести разрыв в нужное место генома. Распознавание мишени происходит на участке длиной от 20 до 30 нуклеотидов. Клетка, подвергшаяся интервенции вирусной РНК, не умрет от внесения разрыва в цепь ДНК, так как она будет исправлена по здоровой копии из парной хромосомы за счет естественного процесса репарации. Если же парной хромосомы нет, как, например, в случае гемофилии, то тогда можно внести в клетку участок нужного, заданного исследователем гена одновременно с Cas9 и РНК-гидом и уже использовать его как матрицу для заполнения внесенного разрыва.
Также с помощью CRISPR/Cas9 можно проводить одновременное редактирование сразу нескольких мутировавших генов. Для этого достаточно ввести Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из гидов направит Cas9 к собственной мишени, что поможет целостно устранить болезнь из генома.
Описанный механизм функционирует за счёт принципа комплементарности. Цепи двойной спирали ДНК распознают друг друга по правилам данного принципа. CRISPR РНК узнает свою цель таким же образом. (А-Т, Г-Ц).