При использовании метода градуировочного графика готовится серия стандартных растворов с разными концентрациями вещества, которые считаются точно известными. Затем для каждого приготовленного раствора в одинаковых условиях получают соответствующую величину аналитического сигнала (измеряют оптическую плотность каждого из растворов (Жебентяев и др, 2011). Для каждой точки делают не менее 3-х параллельных определений. Обычно для расчетов используют линейную зависимость величины аналитического сигнала от концентрации, хотя метод градуировочного графика может быть использован и в случае нелинейных зависимостей. Установление математической зависимости А = f (С) в практике фотометрического анализа для построения градуировочных графиков и расчета коэффициентов уравнения регрессии используется метод наименьших квадратов, который имеет погрешность 1–5% при доверительной вероятности 95 %. В фотометрических методах она выражается обычно линейной и, значительно реже, параболической зависимостью (Моржухина, 2007).
Градуировочный график строят, откладывая по горизонтальной оси известные концентрации С, а по вертикальной – соответствующие им значения оптической плотности А, рассчитанные по методу наименьших квадратов.
Следует убедиться в том, что зависимость концентрации от оптической плотности – линейная (по критерию Фишера), т. е. выражается на графике прямой линией.
По градуировочной кривой (точнее по уравнению линейной регрессии) в дальнейшем определяют неизвестную концентрацию вещества в исследуемых растворах. Для этого раствор наливают в ту же кювету, для которой построена градуировочная кривая, и, включив тот же светофильтр, определяют оптическую плотность раствора. Затем находят концентрацию, соответствующую измеренному значению оптической плотности (Моржухина, 2007).
Линейная градуировочная зависимость описывается уравнением (7), если полученная прямая не проходит через начало координат, и уравнением (8), если проходит. (Жебентяев и др, 2011).
(7)
(8)
Коэффициент b (угловой коэффициент, slope) характеризует угол наклона градуировочного графика (коэффициент чувствительности – S), а свободный член a (intercept) – величина сигнала контрольного опыта. Лучше, если величина a статистически неотличима от 0, т.е. градуировочная зависимость описывается уравнением (8).
Уравнения (7) и (8) можно получить методом наименьших квадратов: коэффициенты a и b должны быть такими, чтобы сумма квадратов отклонений реальных значений от рассчитанных по полученному уравнению была минимальной. Согласно методу наименьших квадратов, коэффициенты a и b рассчитываются по формулам (9) и (10) соответственно.
(9)
(10)
Если же градуировочная зависимость описывается уравнением (7), то для расчета его коэффициента используется формула (11).
(11)
Полученное уравнение градуировочного графика может быть использовано для расчета неизвестной концентрации определяемого вещества по величине аналитического сигнала.
«Качество» полученного градуировочного графика может быть охарактеризовано коэффициентом корреляции(r). Чем ближе значение этого коэффициента к 1, тем меньше разброс точек относительно полученной прямой. Для практических целей рекомендуется использовать градуировочные граики с r ≥ 0,99. Градуировочный график желательно строить в таком интервале, чтобы неизвестная концентрация вещества попадала примерно в его середину, так как погрешность при этом будет минимальной (Жебентяев и др., 2011).