I. Реверсия ракового фенотипа.
Замена мутантной аллели гена на нормальную копию.
Впервые попытка генной терапии в клинике была предпринята М.Клайном в 1983 году., когда им было осуществлено введения нормального бета-глобинового гена больным бета-талассемией. Позднее была разработана методика генной терапии наследственной недостаточности аденозин-деаминазы (тяжелый иммунодефицит): нормальный ген был введен в клетки костного мозга больного и после их ретрансплантации восстановилась активность фермента, состояние больного улучшилось. Проведены клинические эксперименты по генотерапии рака. В лейкоциты больных злокачественной меланомой и поздними стадиями рака были введены гены, маркирующие злокачественные клетки (чтобы их могла узнавать имунная система). У половины больных размеры опухолей уменьшились в два раза и более.
- клетки остеосаркомы имели мутации в гене Rb1; введение кДНК нормального гена Rb1 в эти клетки в культуре вызывало их реверсию;
- в раковые клетки также в культуре вводился нормальный ген wt53; под его действием раковые клетки теряли свойства ракового фенотипа. Из работы не ясно, насколько стабильна реверсия раковых клеток в этих опытах.
Перенос в раковые клетки нормальной аллели гена в случае мутации с потерей функции.
Подавление экспрессии мутантной аллели гена в случае доминантно-негативной мутации.
Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов.
Антисмысловая РНК — получаемый искусственно или природный полирибонуклеотид, комплементарный определенной мРНК и подавляющий ее биологическую активность за счет образования с ней дуплекса, что препятствует трансляции мРНК на рибосомах. Природные А.РНК являются ключевыми компонентами одной из систем негативной регуляции экспрессии генов как у бактерий, так и у эукариот. Для искусственного получения А.РНК в экспрессионный вектор вставляют нуклеотидную последовательность ДНК из целевого гена в обратной ориентации по отношению к промотору, чтобы транскрибировалась незначащая цепь гена с образованием А.РНК; затем на такой рекомбинантной плазмиде осуществляют синтез А.РНК (обычно в бактериальных клетках). Искусственная А.РНК используется в экспериментальной работе, а также как средство для лечения различных патологий. Использовать А.РНК для подавления экспрессии генов впервые было предложено Дж. Изантом и Г. Вайнтраубом в 1984 г
3.2) Использование рибозимов (M 1 субъединица РНКазы P, hammerhead-рибозимы).
Одними из основных различий, обнаруживаемых между нормальными и раковыми клетками, являются генетические различия ряда генов, контролирующих пролиферацию. В геноме опухолевых клеток часто обнаруживают мутации в генах двух типов: онкогенах и генах-супрессорах опухолевого роста, или антионкогенах.
Онкогены эволюционно консервативны и вызывают неопластическую трансформацию клеток как при ретровирусной инфекции в природных условиях (поскольку они часто бывают включены в состав генома ретровирусов), так и после введения ДНК онкогенов в культивируемые клетки с помощью трансфекции. Большинство онкогенов вначале было обнаружено именно в составе генома онкогенных вирусов, и они являются мутантными производными протоонкогенов, присутствующих в здоровых клетках многоклеточных организмов и активирующихся во время эмбриогенеза, роста клеток или регенерации тканей. Поскольку активированные онкогены в опухолевых клетках, как правило, сверхэкспрессируются и кодируемая ими РНК по своей первичной структуре отличается от РНК протоонкогенов, РНК онкогенов являются хорошей потенциальной мишенью для рибозимов. Мутация в кодоне 12 гена H-ras, приводящая к замене GGC на GUC, создает консенсусный сайт, по которому HH-рибозим может расщеплять мутантную мРНК. In vitro было продемонстрировано пятикратное различие в эффективности действия рибозима на мутантную H-ras-РНК и соответствующую РНК дикого типа. Получены H-ras-зависимые линии клеток, стабильно трансформированные экспрессирующим вектором, который направлял синтез HH-рибозима под контролем промотора бета-актинового гена. Для таких клеток характерна пониженная скорость пролиферации, сопряженная с уменьшением внутриклеточных уровней H-ras-РНК и белка р21, кодируемого этим геном. Далее рибозим экспрессировали в клетках линии EJ карциномы мочевого пузыря человека. Введение исходных клеток мышам сопровождалось их быстрой гибелью на фоне развития высокоинвазивных опухолей. В отличие от этого клоны EJ-клеток, экспрессирующих рибозим, в организме мышей обладали резко сниженным опухолевым фенотипом. Образующиеся опухоли были малоинвазивны, и наблюдалось приблизительно двукратное повышение уровня выживаемости мышей с трансплантатами. Гистологические исследования подтверждали слабую способность опухолей к метастазированию. Рибозимы в опухолях обнаруживались методом ПЦР на протяжении 86-90 дней. елковый продукт гена c-fos участвует в передаче сигнала эукариотическими клетками, вовлечен в синтез ДНК и может придавать клеткам устойчивость к противоопухолевым препаратам. Последние два свойства этого белка находят подтверждение в том, что при проведении лечения часто используемым противоопухолевым лекарством цисплатином (цис-диаминодихлорплатина) происходит индукция гена c-fos вслед за генами dTMP-синтазы и ДНК- полимеразы.
Рибозим, разрушающий c-fos-мРНК, снижал конечный уровень экспрессии гена c-fos, приводил к повышению чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам (включая цис- платину) и значительно подавлял экспрессию генов dTMP-синтазы, ДНК-полимеразы бета и гена металлотионеина человека hMTII-A.
Аберрантная филадельфийская хромосома образуется в результате транслокации (9;22)(q34;q11) в стволовых клетках костного мозга, что сопровождается слиянием генов bcr и abl с образованием химерного онкогена bcr/abl и развитием хронических миелоидных лейкозов (ХМЛ). Транскрипт химерного гена кодирует белок р210bcr/abl, который обладает повышенной активностью тирозинкиназы. Такие РНК и белок обнаруживаются почти у всех больных с синдромом ХМЛ, а также у 50% пациентов с острым лимфобластоидным лейкозом, у которых имеется филадельфийская хромосома.
С помощью рибозимов, специфически расщепляющих последовательность химерной мРНК в месте стыковки последовательностей двух генов, удалось подавить экспрессию химерного гена bcr/abl в культивируемых клетках.
Экспрессия рибозимов в культивируемых клетках вызывала снижение уровня bcr/abl-мРНК, полностью блокировала образование химерного белка р210bcr/abl и ингибировала рост клеток на 84%. Эти результаты были значительно лучше эффектов, вызываемых антисмысловыми олигонуклеотидами.
В других работах был получен рибозим, расщепляющий химерную РНК по кодону GUU, расположенному по соседству с местом стыковки последовательностей двух генов. Этот рибозим разрушал соответствующую РНК in vitro и in vivo, а также подавлял тирозинкиназную активность белка р210.