В. Иммунологический метод диагностики

Менингококковых заболеваний

Для диагностики менингококковых инфекций помимо классического бактериологического способа используют также различные серологические реакции, позволяющие обнаружить антигены возбудителя в спинномозговой жидкости и в крови. С этой целью применяют реакции коагглютинации, латекс-агглютинации, встречного иммуноэлектрофореза, реакцию пассивной гемагглютинации и эритроиммуноадсорбцию. Последний метод предложен, в частности, для обнаружения полисахаридного антигена серогруппы А (наиболее частого возбудителя менингита). Суть метода заключается в том, что луночки полистиролового планшета сенсибилизируют противоменингококковыми антителами, затем в них добавляют исследуемый материал, содержащий искомый антиген. Смесь инкубируют при 37°C в течение 30-60 мин для связывания антигена антителами. После отмывания в луночки добавляют эритроцитарный диагностикум (эритроциты, несущие антитела к менингококку группы А). В качестве положительного контроля в одну из луночек добавляют полисахарид группы А, отрицательного - эритроциты без антител. Реакцию учитывают через 20 мин седиментации при 22°C визуально и оценивают по 4-х крестной системе. В случае положительной реакции комплекс антитело-антиген взаимодействует с сенсибилизированными эритроцитами, в результате образуется гомогенный слой эритроцитов, фиксированных на стенках луночек. При отрицательной реакции эритроциты скатываются на дно, образуя компактный осадок.

МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

ГОНОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

А. Бактериоскопический

Материал: гной из мочеполовых органов, с конъюнктивы глаза
По Граму	Метиленовым синим

Б. Бактериологический

Материал: гной из мочеполовых органов, конъюнктивы глаза, синовиальная жидкость, кровь
	u 76anRxDRTPHPDL/4jA4VM+39iXQQvYJ5mrOT7ylXYj3LFxmIPQ/zZQayKuX/BtUPAAAA//8DAFBL AQItABQABgAIAAAAIQC2gziS/gAAAOEBAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABbQ29udGVudF9UeXBl c10ueG1sUEsBAi0AFAAGAAgAAAAhADj9If/WAAAAlAEAAAsAAAAAAAAAAAAAAAAALwEAAF9yZWxz Ly5yZWxzUEsBAi0AFAAGAAgAAAAhAGcm3oYpAgAANAQAAA4AAAAAAAAAAAAAAAAALgIAAGRycy9l Mm9Eb2MueG1sUEsBAi0AFAAGAAgAAAAhANVVt0/fAAAACQEAAA8AAAAAAAAAAAAAAAAAgwQAAGRy cy9kb3ducmV2LnhtbFBLBQYAAAAABAAEAPMAAACPBQAAAAA= " fillcolor="#ff6"/>
Асцит-агарСывороточный агар+ ристомицин,+ мальтоза,+водный голубой
	Специальная питательная среда
Микроскопия	Пестрый ряд	Чувствительность к антибиотикам

В. Серологический – РСК, РНГА со стандартным гонококковым антигеном.

Г. Экспресс диагностика:1) иммуно-люминесцентная микроскопия

2) ПЦР; мультиплексная ПЦР – комбинированный тест на выявление Neisseria gonorrhoeae, Chlamidia trachomatis и Trichomonas vaginalis.

МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

МИКОПЛАЗМЕННЫХ ИНФЕКЦИЙ

А. Бактериоскопический

Материал: мокрота, мазки из зева,смывы из носоглотки, биоптаты легочной ткани, плеральная жидкость, моча, отделяемое уретры и влагалища, режесиновиальная жидкостьа
По Граму	По Романовскому -Гимза

Ввиду полиморфизма возбудителей вактериоскопический метод носит второстепенный (ориентировочный характер).

Б. Бактериологический

Материал: гной из мочеполовых органов, конъюнктивы глаза, синовиальная жидкость, кровь G Z8Lcd0jsHX3vTGTZV9L2ZuRy18qHJEmlMw3xhdp0+FZj+a0Hp6DcfSxJd+P7/lUPXuvtcXtGqdT9 3fTyDCLiFP/CcMFndCiY6eAHskG0ClZpuuCoghkP9q/6wMvTCmSRy/8PFL8AAAD//wMAUEsBAi0A FAAGAAgAAAAhALaDOJL+AAAA4QEAABMAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAFtDb250ZW50X1R5cGVzXS54 bWxQSwECLQAUAAYACAAAACEAOP0h/9YAAACUAQAACwAAAAAAAAAAAAAAAAAvAQAAX3JlbHMvLnJl bHNQSwECLQAUAAYACAAAACEA/h8s3GECAAB4BAAADgAAAAAAAAAAAAAAAAAuAgAAZHJzL2Uyb0Rv Yy54bWxQSwECLQAUAAYACAAAACEAY8OcYNwAAAAIAQAADwAAAAAAAAAAAAAAAAC7BAAAZHJzL2Rv d25yZXYueG1sUEsFBgAAAAAEAAQA8wAAAMQFAAAAAA== " adj="-214383,-1,-214383" strokeweight="2.25pt">

МПА + лошадиная сыворотка + дрожжевой экстракт
	Специальная питательная среда
РИФ	Пестрый ряд	Чувствительность к антибиотикам

В. Серологический.

В связи с широким распространением носительства микоплазм результат бактериологического метода подтверждают серологическим. Для серологической диагностики ставят РСК, РНГА, ИФА, реация ингибиции метаболизма с использованием метода парных сывороток (диагностическое значение имеет увеличение титра поздней сыворотки в 4 и более раз).

Г. Экспресс диагностика:1) иммуно-люминесцентная микроскопия;

2)ПЦР;

3) метод гибридизации на основе ДНК-зондов.

ЗАНЯТИЕ № 4

Дата________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЯМИ, АКТИНОМИЦЕТАМИ, ЛИСТЕРИЯМИ

План занятия

1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий.

2. Типы дифтерийных бактерий. Разбор особенностей роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах.

3. Биохимические свойства коринебактерий. Дифференциация истинных дифтерийных бактерий от псевдодифтерийных и дифтероидов по биохимическим свойствам. Демонстрация и разбор.

4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор.

5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Разбор схемы исследования дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя).

6. Определение токсигенности дифтерийных бактерий реакцией преципитации в агаре и биопробой на морской свинке. Разбор и демонстрация.

7. Изучение морфологии и культуральных свойств Listeria monocytogenes.

8. Изучить морфологию возбудителя актиномикоза на демонстрационных препаратах. Познакомиться с культуральными особенностями возбудителя актиномикоза.

9. Разобрать схему бактериологической диагностики актиномикозов

Методические указания

1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий

Готовые фиксированные мазки из чистой культуры дифтерийной палочки окрасить синькой Леффлера и по Нейссеру. Дифтерийные бактерии окрашиваются неравномерно, более интенсивно окрашиваются зерна волютина. При окраске синькой Леффлера зерна валютина (зерна Бабеша-Эрнста) красятьс в более темный цвет чем тело, это явление назваеться метахромазией. По способу Нейссера зерна окрашиваются в темно-синий, почти черный цвет, а тело бактерий - желтый. Дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу в виде римской цифры V. Препараты промикроскопировать и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя дифтерии на свернутой сыворотке, на теллуритовых средах.

2. Типы дифтерийных бактерий. Разбор особенностей роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах

Разбор особенностей колоний различных типов дифтерийной палочки на теллуритовой среде – форма, размеры, цвет, блеск. Характер их роста на жидких средах - помутнение, осадок, пленка.

Знакомство с биохимическими свойствами дифтерийной палочки по биохимическим наборам. Демонстрация и разбор. Заполнить таблицу.

Таблица 1. Свойства дифтерийной палочки и близких к ней

коринебактерий

Вид	Сахароза	Глюкоза	Крахмал	Проба Пизу	Проба на уреазу	Токси-генность
Дифтерийная палочка
Дифтероид
Ложнодифтерийная палочка

Обозначить знаками + или -.

Знак + означает наличие признака. Знак – означает отсутствие признака.

4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор

Исследованию подвергаются слизь или пленка из зева, носа, носоглотки, миндалин. Реже исследуется материал с конъюнктивы глаза, со слизистой оболочки половых органов или с поверхности ран. Материал берут двумя стерильным тампоном. Один используют для приготовления препарата- мазка. Другой для бактериологического исследования, его погружают в стерильную пробирку с этикеткой, на которой указаны фамилия, имя, отчество, возраст больного и из какого места (полости) взят материал. Пробирки с материалом помещают в металлические пеналы и с нарочным отправляют в лабораторию для доследования. Разбор методики взятия материала из зева, носа и других мест и посева его при дифтерии.

5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Разбор схемы исследования дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя)

С помощью стерильного ватного тампона произвести друг у друга забор материала со слизистой зева или носа и сделать посев на сывороточную среду с теллуритом.

Произвести макро- и микроскопическое изучение выросших подозрительных колоний. Препараты окрасить синькой Леффлера, по Граму и по Нейссеру. Результаты зарегистрировать в тетради. При обнаружении коринебактерий сделать посев на среды с глюкозой, сахарозой, цистином и мочевиной. Одновременно сделать посев для определения токсигенности бактерий.

Методика определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии преципитацией в агаре заключается в следующем. Полоски фильтровальной бумаги размером 1,5x8 см, простерилизованные в автоклаве, смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, разведенной стерильным физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в 1 мл. Смоченную сывороткой бумажку стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашку Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от фильтровальной бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых заведомо токсигенный и служит контролем. Чашки с посевом помещают в термостат при температуре 37°С. Результат учитывают в течение 48 часов. В месте взаимодействия антитоксина с токсином образуется линия преципитации. Если исследуемая культура образует токсин, то ее линия преципитации сливается с линией преципитации контрольного штамма, образуя сплошную белую полоску. При неспецифической преципитации линия, образуемая исследуемым штаммом, пересекает или имеет тенденцию к пересечению с линией контрольного штамма.

Демонстрация чашек с культурами токсигенной и нетоксигенной дифтерийной палочки. Зарисовать схему определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии.

Определить токсигенные свойства дифтерийной палочки можно также методом биопробы. Для опыта берут двух морских свинок, накануне одной из них вводят 500-1000 АЕ антитоксической противодифтерийной сыворотки. Затем свинкам вводят подкожно (0,2 мл) или внутрикожно (0,1 мл) исследуемую культуру. Если испытуемая культура токсигенна, то при подкожном введении опытная свинка через 2-5 дней погибает. При вскрытии обнаруживается отек в месте введения культуры, экссудат в брюшной и грудной полостях и в перикарде. Особенно характерным симптомом является увеличение и гиперемия надпочечников. Контрольная свинка остается живой. При внутрикожном введении токсигенной культуры у опытной свинки в месте инъекции наблюдается покраснение, отечность, а в дальнейшем - некроз. У контрольной морской свинки никаких изменений не отмечается.

7.Изучение морфологии и культуральных свойств Listeria monocytogenes

Промикроскопировать готовый препарат-мазок из культуры листерий, окршенный по Граму и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя листериоза на сывороточном МПА, сахарном МПБ.

Промикроскопировать готовый препарат-мазок из чистой культуры актиномицетов и друзу актиномицета, окршенный по Граму и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя актиномикоза на среде Сабуро.


Рис. 1. Окраска по Нейссеру	Рис. 2. Окраска метиленовым синим
Corynebacterium diphtheriae

Рис.3. Схема определения токсигенных свойств дифтерийных бактерий реакцией преципитации в агаре	Рис.4. Listeria monocytogenes Окраска по Граму

Рис. 5. Actinomyces israelii Окраска по Граму	Рис.6. Друза актиномицета Окраска по Граму

Контрольные вопросы

1. Какие микробиологические методы применяются для диагностики дифтерии?

2. Какой материал берется для исследования при подозрении на дифтерию и при обследовании на бактерионосительство?

3. Какие морфологические признаки присущи дифтерийной палочке?

4. Каковы тинкториальные особенности возбудителя дифтерии?

5. По каким признакам дифференцируют типы гравис, митис и интермедиус?

6. По каким биохимическим признакам отличают дифтерийную палочку от дифтероидов?

7. В чем заключается сущность пробы Пизу?

8. Какими методами и как определяют токсигенность возбудителя дифтерии?

9. Каковы пути и способы заражения дифтерией?

10. Какова роль дифтерийного батерионосительства в эпидемиологии дифтерии?

11. Как используют РПГА для обнаружения в сыворотке детей антитоксина?

12. Почему для микробиологической диагностики дифтерии необходимо выделение чистой культуры возбудителя и изучение его свойств?

13. Каковы морфологические, тинкториальные, кулътуральные и биохимические признаки листерий?

14. Какие методы микробиологической диагностики применяют при листериозе?

15. Как проводится бактериологическая и серологическая диагностика листериоза?

16. Какими факторами патогенности обладает возбудитель дифтерии?

17. Каковы способы и пути передачи возбудителя дифтерии?

18. Что поражает (какие органы и системы органов) дифтерийный токсин?

19. Каковы особенности генетического контроля синтеза токсина у возбудителя дифтерии?

20. Каковы природа и структура дифтерийного токсина?

21. Каков молекулярный механизм действия дифтерийного токсина и какой процесс в клетке он блокирует?

22. Каким образом осуществляется активация дифтерийного токсина?

23. Каким образом возможно превращение нетоксигенной дифтерийной бактерии и токсигенную?

24. Каковы особенности современной классификации дифтерийных бактерий, и какие критерии с этой целью используются?

25. Каковы морфологические, тинкториальные и кулътуральные признаки актиномицетов?

26. Какие методы микробиологической диагностики применяют при актиномикозов?

27. Как проводится бактериоскопический, бактериологическая и серологическая диагностика актиномикоза?

28. Какими факторами патогенности обладает возбудитель актиномикоза?

МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ

А. Бактериологический

Материал: от больного – слизь и воспалительный налет из зева, носа, миндалин, носоглотки и т.д., на бактерионосительство – слизь из зева и носа.
Среда с теллуритом		Сывороточная среда
Микроскопия окраска по Граму, по Нейссеру и синькой Леффлера,	Свернутая сыворотка	Определение токсигенности преципитацией в агаре
Биохимические свойства – среды с глюкозой, сахарозой, крахмалом, цистином, мочевиной	Фаготипирование	Определение серотипа

МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИСТЕРИОЗА

А. Бактериоскопический

Имеет второстепенное значение, в связи с отсутствием морфологических особенностей. Применяют для изучения органов павших животных, а также новорожденных, погибших от листериоза. Готовят мазки-отпечатки, фиксируют смесью Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимзе или по Граму. Листерии имеют вид грамположительных коротких, умеренно толстых палочек, иногда нитей или кокков, расположенных одиночно или в форме частокола.

Б. Бактериологический (на ранних стадиях заболевания).

Материал для исследования на листерии — кровь, СМЖ, слизь из зева, пунктаты увеличенных лимфатических узлов, у новорождённых дополнительно — меконий, пупочная кровь; секционный материал (кусочки мозга, печени, селезёнки, лимфатические узлы). Посевы рекомендуют делать в первые 7-10 сут. болезни. Кровь и СМЖ засевают на плотные среды (глюкозный, глюкозо-печёночный или КА с глюкозой), в 100-200 мл глюкозного, глюкозно-печеночного или глюкозно-глицеринового бульона. Материал плотной консистенции эмульгируют в изотоническом растворе хлорида натрия и сеют на глицериновый или кровяной агар с теллурита калия или полимиксина (1-5 мкг / мл). Если изучаемый материал очень загрязнен посторонней микрофлорой, лучше сначала ввести его белым мышам или гвинейским свинкам и после их гибели печени и селезенки сделать мазки-отпечатки и посевы. Засеяны среды инкубируют при 37 ° С в течение 7 суток, ежедневно контролируя наличие роста путем бактериоскопии. Выросшие колонии отбирают для дальнейших исследований по наличию гемолитической активности (на средах с кровью) либо по способности приобретать сине-зелёную окраску при косом освещении. Идентификацию выделенных культур осуществляют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам. Листерии каталазоположительны, ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, салицин, не разлагаются маннит и глицерин. Свежие культуры дают положительную конъюнктивальную пробу в гвинейских свинок. Через 2 часа после внесения капли бульонной культуры листерий в конъюнктивальный мешок развивается гнойное воспаление конъюнктивы.

В. Серологический

Проводят со второй недели заболевания. С сывороткой крови больного и стандартным антигеном ставят РСК (диагностический титр 1:5 и выше). Применяют РНГА (для выявления хронического листериоза). AT сохраняются не менее 1 - 2лет после выздоровления (реакция может быть использована для ретроспективного анализа).

Г. Биологический

Для биологической диагностики листериоза лучше всего использовать белых мышей, иммуносупрессированных введением кортизона (4-5 мг в/м за 4 ч до заражения). После гибели животного (обычно на 2-6-е сутки) проводят посев материала из различных органов. Следует помнить, что листе-рии размножаются в мёртвых тканях, и для избежания диагностических ошибок часть патологического материала следует поместить в стерильные пробирки и хранить в течение 5 - 10 сут при температуре 4-6° С, а затем подвергнуть повторному исследованию.

Д. Ускоренная диагностика

ПЦР. Применяют тест-ситемы для определения вирулентных Listeria monocytogenes в клинических образцах, молоке и других пищевых продуктах. В качестве праймера ичпользуют последовательность генов листериолизина О. Чувствительность метода – 5-50 клеток в пробе.

МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

АКТИНОМИКОЗА

А. Бактериоскопический

Бактериоскопию проводят для выявления друз. Наиболее распространённый метод лабораторной диагностики актиномицетов — обнаружение друз A. israelii в экссудате или гнойном отделяемом из очагов поражения. Последние могут достигать значительных размеров, образуя так называемые серные гранулы или тельца Боллингера размером в среднем 0,3-2 мм. Для поиска более мелких друз исследуемый материал (гнойное отделяемое, мокрота, биоптаты и СМЖ) помещают на предметное стекло в каплю 10-20% раствора КОН или NaOH, подогревают, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Друзы актиномицетов имеют плотную, каменистую консистенцию и скрипят как песок при надавливании на покровное стекло. Друзы актиномицетов также можно исследовать методом «раздавленной» капли либо в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе или Граму. Они образованы агрегатами мицелия, имеющими вид округлых или овальных базофильных масс с эозинофильными включениями (очевидно, что это AT) на поверхности.

Б. Бактериологический

Патологический материал от больных, как правило, загрязнен посторонней микрофлорой. Для избавления от нее материал центрифугируют в растворе пенициллина и стрептомицина, затем отмывают от антибиотиков 0,85% раствором NaCl. Для освобождения от сопутствующей флоры можно внести в пробирку 50% раствор глицерина и выдержать 2-3 суток при 37 ° С. Для выделения чистых культур актиномицетов проводят посев на кровяной и сывороточный агары, среды Сабуро или Чапека, тиогликолевую среду, сердечно-мозговой МПА. Посевы актиномицетов инкубируют в аэробных и анаэробных условиях в течение 1 -2 нед. По периферии образующихся микроколоний имеются многочисленные ветвящиеся нити. Через 1-2 недели формируются плоские морщинистые или бугристые зрелые колонии_.Идентификация выделенной культуры проводится по совокупности биологических свойств.

В. Серологический

Серологическая диагностика проводится редко. Используют реакции связывания комплемента и непрямой гемагглютинации. Антигеном служит актинолизат. Но обе реакции могут давать положительные результаты и при других заболеваниях (рак легких, тяжелые гнойные процессы). Несколько большее диагностическое значение имеют иммунологические тесты: реакция торможения миграции лейкоцитов и аллергическая проба с актинолизатом, а также количественное определение иммунокомпетентных клеток. Внутрикожная проба при висцеральном актиномикозе часто бывает отрицательный.

Г. Аллергический

Аллергическую пробу со стандартным корпускулярным антигеном, или антигеном, полученным путем кислотного гидролиза культуры листерий, ставят на 6-9-й день заболевания. Его вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24-48 часов. Пробу считают положительной, если возникает гиперемия кожи и инфильтрат диаметром 1-2 см.

ЗАНЯТИЕ № 5

Дата________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА, МИКОБАКТЕРИОЗОВ, ЛЕПРЫ

План занятия

1. Правила взятия и пересылки в лабораторию патологического материала от больного туберкулезом.

2. Морфология туберкулезных бактерий - микроскопия готовых препаратов.

3. Культуральные свойства туберкулезных бактерий. Рост туберкулезной палочки на жидких и твердых питательных средах (демонстрация).

4. Бактериоскопическая диагностика туберкулеза. Микроскопия материала с окраской по Цилю-Нильсену. Методы обогащения.

5. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Применение метода микрокультур (метод Прайса) для ускоренной диагностики туберкулеза (разбор и демонстрация).

6. Палочка проказы - микроскопия готовых препаратов.

7. Изучение иммунопрепаратов, применяемых для диагностики и профилактики туберкулеза.

Методические указания

1. Правила взятия и пересылки в лабораторию патологического материала от больного туберкулезом

Материалом для исследования чаще служит мокрота. Реже используются моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения. Материал собирают в стерильную баночку, закрывают пробкой. К присылаемому на анализ материалу прилагается бланк лечебного учреждения, в котором четко указывается название материала, цель исследования и предполагаемый диагноз. Кроме того, указывается фамилия, имя, отчество и возраст больного.

2. Морфология туберкулезных бактерий - микроскопия готовых препаратов

Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.


Рис. 1.Mycobacterium tuberculosis Окраска по Цилю-Нильсену	Рис.2. Микрокультура Mycobacterium tuberculosis	Рис. 3. Mycobacterium leprae Окраска по Цилю-Нильсену

3. Культуральные свойства туберкулезных бактерий. Рост туберкулезной палочки на жидких и твердых питательных средах (демонстрация)

Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.

4. Бактериоскопическая диагностика туберкулеза. Микроскопия материала с окраской по Цилю-Нильсену. Методы обогащения

Перед исследованием мокроту выливают в чашку Петри, поставленную на темном фоне. Из мокроты необходимо выбрать гнойные комочки, приготовить препарат-мазок, окрасить по Цилю-Нильсену. Промикроскопировать, обратив внимание на наличие прямых или слегка изогнутых тонких палочек, часто зернистых, расположенных одиночно или группами. Палочки окрашены в красный цвет, а лейкоциты, посторонние бактерии и слизь - в синий. Препарат зарисовать.

Если содержание туберкулезных бактерий настолько мало, что их не удается обнаружить в мазках, поэтому ранее широко пользовались одним из методов обогащения - методом осаждения или методом флотации.

Метод осаждения. К мокроте добавляют равное по объему количество однопроцентного едкого натра, плотно закрывают склянку и встряхивают ее в течение 5-15 минут до полного растворения мокроты, центрифугируют, сливают жидкость, осадок нейтрализуют 1-2 каплями десятипроцентного раствора соляной кислоты. Из осадка, в котором сконцентрированы туберкулезные бактерии, приготовляют мазки, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют.

Метод флотации. Мокроту помещают во флакон или колбу с резиновой пробкой емкостью в 250 мл, добавляют равное количество 0,5-1% едкого натра, встряхивают 5-10 минут до полной гомогенизации. Колбу помещают в водяную баню и прогревают при 55°С в течение 30 минут, затем добавляют около 100 мл дистиллированной воды и 1-2 мл ксилола, бензина или газолина. Смесь встряхивают в течение 5-10 минут, еще вливают в колбу около 100 мл дистиллированной воды (до установления уровня жидкости в узкой части горловины) и оставляют при комнатной температуре на 20-30 минут. Образовавшийся сливкообразный слой переносят пипеткой на предметное стекло, которое кладут на крышку водяной бани, нагретой до 60°С. На высохший мазок наносят новые порции материала до тех пор, пока весь флотационный экстракт не будет перенесен на предметное стекло. Сухой препарат промывают эфиром для удаления ксилола или бензина, фиксируют на пламени, красят по Цилю-Нилъсену и микроскопируют.

5. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Применение метода микрокультур (метод Прайса) для ускоренной диагностики туберкулеза (разбор и демонстрация)

Знакомство с методом микрокультур (метод Прайса) для ускоренной диагностики туберкулеза. Демонстрационный препарат микрокультуры туберкулезной палочки промикроскопировать и зарисовать. Микрокультура возбудителя туберкулеза выглядит в виде тяжей или скоплений, похожих на канат или косу и состоящих из туберкулезных палочек.

6. Палочка проказы - микроскопия готовых препаратов

Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты палочки проказы. В отличие от туберкулезной палочки возбудитель проказы располагается параллельными рядами (в виде пачек сигар), преимущественно внутри клеток.

7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин РРD-L, вакцина БЦЖ.

Методы микробиологической диагностики туберкулеза

А. Бактериоскопический

Материал: гной, мокрота, моча и т.д.
Микроскопия Окраска по Цилю-Нильсену	Методы обогащения (осаждение, флотация)
	Микроскопия Окраска по Цилю-Нильсену	Метод люминесцентной микроскопии (аурамин, аурамин-родамин)

Б. Бактериологический

Материал: гной, мокрота, моча и т.д.
Предварительная обработка 6%-ной серной кислотой и отмывание физиологическим раствором
Посев на среды	Метод микрокультур Микроскопия Окраска по Цилю-Нильсену	Цитратная кровь (3-7 дней)
	Определение чувствительности к антибиотикам

В. Биологический

Материал: гной, мокрота, моча и т.д.
Предварительная обработка серной кислотой, отмывание физиологическим раствором
Макро- и микроскопия органов погибшего животного	Заражение морской свинки

Г. Аллергический – Проба Манту, Пирке.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические особенности туберкулезной палочки?

2. Каковы тинкториальные свойства возбудителя туберкулеза?

3. Как растут туберкулезные палочки на жидких и твердых питательных средах?

4. Какие существуют типы туберкулезной палочки, и какова их роль в патологии человека?

5. По каким свойствам различают патогенные типы туберкулезных палочек?

6. Как классифицируют микобактерии по скорости роста и фотоактивации пигментообразования?

7. Почему возбудители туберкулеза относительно устойчивы к воздействию внешних факторов?

8. Какие лабораторные животные чувствительны к туберкулезной палочке?

9. Как происходит заражение человека туберкулезом?

10. Каков характер фагоцитоза при туберкулезе?

11. Какова природа иммунитета при туберкулезе?

12. Какую роль играют лимфоциты в реакции повышенной чувствительности замедленного типа при туберкулезе?

13. Какова природа туберкулина, его назначение и применение?

14. Каковы факторы патогенности туберкулезной палочки?

15. Какие микробиологические методы применяются для диагностики туберкулеза?

16. Как осуществляется бактериоскопическая диагностика туберкулеза?

17. Какие методы используют для обогащения материала при бактериоскопической диагностике туберкулеза?

18. Как ставится биологическая проба для диагностики туберкулеза?

19. Как осуществляется ускоренная диагностика туберкулеза (метод микрокультур)?

20. Каково значение туберкулиновых проб в диагностике туберкулеза?

21. Какие препараты применяются для диагностики и специфической профилактики туберкулеза?

22. Что такое микобактериозы? Их возбудители?

23. Каковы морфологические свойства возбудителя проказы?

24. Какие микробиологические методы используются для диагностики проказы?

25. Какие методы применяются для дифференциации палочки Гансена от туберкулезной палочки?

26. Какие иммунологические реакции используются для диагностики проказы?

27. По каким признакам отличают истинные туберкулезные бактерии от потенциально патогенных и сапрофитных микобактерий?

28. Почему необходимо определять чувствительность туберкулезных бактерий к антибиотикам?

ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 5

А. Микобактерии, потенциально патогенные для человека:

M. africanum M. intracellulare M. paratuberculosis

M. asiaticum M. kansasii M. scrofulaceum

M. avium M. leprae M. senegalense

M. bovis M. lepraemurium M. szulgai

M. chelonei M. malmoense M. tuberculosis

M. farcinogenes M. marinum M. ulcerans

M. fortuitum M. microti M. xenopi

M. haemophilium M.porcinum M. vaccae

Б. Схема идентификации микобактерий

В. Иммунологический метод диагностики

Поиск по сайту