Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антительный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.
А. Возбудитель холеры относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio, в составе которого уже более 30 видов. Род Vibrio включает следующие виды, имеющие медицинское значение: V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. anginolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. mimicus.
К роду Vibrio относятся грамотрицательные, не образующие спор и капсул палочки, изогнутые (1/4 окружности или витка спирали) или прямые, с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительные, образующие кислоту без газа из d-глюкозы путем гликолиза по схеме Эмбден-Мейергофа (до молочной кислоты), имеющие декарбоксилазы лизина и орнитина, лишенные аргининдигидролазы, разжижающие желатин, восстанавливающие нитраты в нитриты и не образующие сероводорода.
Вид V. cholerае разделяют на следующие 4 биовара: Vibrio cholerae O1 cholerae, V. cholerae eltor), V. cholerae O139 bengal, V. cholerae non O1 - включает все холероподобные вибрионы, не относящиеся к O1-серологической группе. Первые три относятся к двум серогруппам – O1 и O139. Последний биовар включает прежние биотипы V. proteus и V. albensis и представлен многими другими сероварами вибрионов, которые не агглютинируются O1- и O139-сыворотками, т. е. НАГ-вибрионами. По О-антигену холероподобные (НАГ-) вибрионы разделяются на несколько десятков серогрупп. Могут вызывать холероподобные диареи. Вибрионы этих серогрупп идентифицируют с помощью соответствующих О-сывороток.
Б. Характеристика холерных и холероподобных вибрионов
| Признаки | Вибрионы | |
| холерные | холероподобные | |
| Форма | в виде запятой | в виде запятой |
| Подвижность | + | + |
| Биохимические группы по Хейбергу | I | I-VIII |
| Агглютинация холерной сывороткой серогрупп О1 или О139 | + | - |
| Лизис специфическим монофагом | + | - |
| Диастатическая активность (на крахмал) | + | - (+) |
| Устойчивость к хлору при экспозиции 30 минут | предельная доза 0,4 мг/л воды | предельная доза 0,5-2 мг/л воды |
В. Дифференциальные признаки биоваров холерных вибрионов
(классического и Эль Тор)
| Признаки | Биотипы | |
| классический | Эль Тор | |
| Гемолиз эритроцитов барана | - (+) | + (-) |
| Агглютинация куриных эритроцитов | - (+) | + (-) |
| Рост на среде с полимиксином (50 ед/мл) | - | + |
| Лизис фагом С (IV группа Мукерджи) в рабочем разведении (10-3) | + | - |
| Лизис фагом Эль Тор 2 в рабочем разведении (10-1 - 10-2) | - | + |
| Реакция Фогес - Проскауэра | - | + |
Г. Дифференциальные признаки патогенных и непатогенных
Галофильных вибрионов
| Признак | Vibrio parahaemolyticus | Vibrio alginolyticus |
| Рост в отсутствие NaCl | - | - |
| Рост в присутствии 7% NaCl | + | + |
| Рост в присутствии 10% NaCl | - | + |
| Ферментация сахарозы | - | + |
| Реакция Фогес - Проскауэра | - | + |
| Феномен роения | - | + |
| Гемолиз на среде с 7% NaCl | + | - |
Д. Холерный вибрион представлен тремя сероварами:
| Серотипы | Антигенная формула | Агглютинация сыворотками | ||
| О | Огава | Инаба | ||
| Огава | AB | + | + | - |
| Инаба | AC | + | - | + |
| Гикошима | ABC | + | + | + |
Е. Биохимическая характеристика вибрионов по Хейбергу, Смиту и Гуднеру
| Углеводы | Группы | |||||||
| Манноза | + | - | + | - | + | - | + | - |
| Арабиноза | - | - | + | + | - | - | + | + |
| Сахароза | + | + | + | + | - | - | - | - |
Ж. Определение холерогенности (энтеротоксигенности) V. cholerae
Косвенные признаки отсутствия холерогенности у вибриона:
1. наличие гемолитической активности,
2. отсутствие больных холерой;
3. отрицательные пробы с холерными диагностическими фагами (ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5).
Прямые методы обнаружения холерогена:
1. стимуляция клеточной аденилатциклазы в культурах клеток;
2. биологические пробы (на крольчатах-сосунках или на лигированной петле тонкого кишечника кролика);
3. реакция пассивного иммунного гемолиза (холероген взаимодействует с ганглиозидом эритроцитов, добавление антитоксинов и комплемента приводит к гемолизу);
4. иммуноферментный метод;
5. иммунофлуоресцентный метод;
6. ПЦР для обнаружения гена токсигенности.
ЗАНЯТИЕ № 10
Дата________________
Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ (столбняк, ботулизм)
План занятия
1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.
2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.
3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики столбняка. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.
4. Биологическая проба на мышах для обнаружения ботулинического токсина. Разбор методики.
5. Демонстрация иммунопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.
Методические указания
1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.
Готовые препараты-мазки из чистых культур патогенных анаэробов окрасить по Граму, промикроскопировать. Препараты зарисовать. Обратить внимание на характер расположения спор, отношение к окраске.
2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.
Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики столбняка. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.
Для выделения чистых культур анаэробов берется раневое отделяемое. Исследование начинается с предварительной микроскопии исходного материала. Для этого готовят мазки и окрашивают по Граму. Обратить внимание на наличие капсул. Препараты зарисовать.
Посев производится на регенерированную, то есть предварительно прогретую на кипящей водяное бане в течение 10-20 мин для освобождения от растворенного в ней кислорода, среду Китта-Тароцци..
Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.
5. Демонстрация препаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.
| Рис. 1. Патогенные анаэробы Окраска по Граму | Рис.2. Анаэробы в раневом отделяемом Окраска по Граму | Рис.3. Выделенная культура анаэробов Окраска по Граму |
Контрольные вопросы
1. Каковы основные биологические свойства анаэробных бактерий?
2. Какова роль анаэробных бактерий в патологии человека?
3. Какие заболевания вызывают анаэробные бактерии?
4. Каков механизм заражения при газовой гангрене?
5. Что является средой обитания анаэробных бактерий в естественных условиях?
6. Каковы основные морфологические, культуральные и биохимические особенности возбудителя столбняка?
7. Какова природа токсина столбнячной палочки и на что он действует?
8. Чем отличается картина столбняка у человека и у мелких лабораторных животных?
9. Что является средой обитания для столбнячной палочки?
10. Чем объясняется высокая обсемененность почвы столбнячной палочкой в Краснодарском крае?
11. Каковы основные морфологические и биологические свойства возбудителя ботулизма?
12. Какова природа токсина палочки ботулизма? Какие типы токсина продуцирует возбудитель и что поражает токсин?
13. Какие условия способствуют размножению возбудителя ботулизма и накоплению токсина в пищевом продукте?
14. Какой материал берется для исследования при подозрении на ботулизм?
15. Какие методы применяются для обнаружения токсина возбудителя ботулизма и определения его типа?
16. Какие продукты чаще всего являются причиной отравления при ботулизме?
17. Как осуществляется специфическая профилактика и лечение ботулизма? Какие препараты применяются для этой цели?
18. Что представляет собой протоксин?
19. Какова природа и структура столбнячного токсина?
20. Как активируется столбнячный токсин?
21. Что поражает столбнячный токсин?
22. Каковы функции тяжелой и легкой цепей столбнячного токсина?
23. Как продвигается столбнячный токсин к ядрам двигательных нервов?
24. Каков защитный уровень антитоксина против столбнячного токсина?
25. Как осуществляется специфическое лечение и специфическая профилактика столбняка?
26. Как обеспечивается формирование коллективного иммунитета против столбняка и какие препараты применяют для этой цели?
27. Что такое прогенитарные токсические комплексы, образуемые палочкой ботулизма?
28. Какие структурные варианты прогенитарных токсических комплексов Вы знаете? Каков их состав?
29. Как происходит активация ботулинического токсина?
30. Какая разница между протеолитическими и непротеолитическими вариантами возбудителя ботулизма? Каким образом осуществляется у них активация токсина?
31. В чем заключается механизм активации ботулинического токсина?
32. Какие функции выполняют нетоксические белки в составе белковых комплексов?
33. Каковы физико-химические свойства токсина ботулизма? Какие токсины, кроме нейротоксина, образует возбудитель ботулизма?
34. Ботулизм - интоксикация или токсикоинфекция? Что поражает ботулинический токсин?
35. Какой синдром чаще всего наблюдается у больных ботулизмом?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 10