История метода клеточных культур растений. Методики и подходы.
Работы по изолированию культур, когда зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях, принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ и Саксу (1893). В 1902 г. Г. Габерланд научился культивировать отдельные клетки в течение некоторого времени и выдвинул гипотезу о тотипотентности (свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую её дифференцировку и развитие до целого организма), которая впоследствии была подтверждена экспериментально.
В монографии «Культура растительных тканей» (1949) Филипп Уайт выделяет несколько периодов в истории развития метода культуры клеток, тканей и органов растений:
1. 1834 -1900 гг. - создание и разработка клеточной теории.
2. 1900 –1922 гг. - сформулирована идея культуры тканей.
3. 1922 – 34 гг. - безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное культивирование тканей.
4. 1934 - 39 гг. - детальная разработка техники культуры растительных тканей.
Период 1940 - 1960 гг. значительно расширил список видов растений, выращиваемых in vitro. В 1960 - 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов и разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей (Р.Г. Бутенко, Ю.Ю. Глеба). Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток. Начиная с 1976 г., разрабатывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельскохозяйственных растений, создание системы иммобилизованных клеток для получения различных химических соединений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.
Первичные и вторичные метаболиты, их характеристика.
Проблемы синтеза вторичных метаболитов.
Растения с давних времен использовали не только в качестве источника питания, но и как поставщиков широкого набора химических соединений, включая лекарственные препараты, инсектициды, пищевые добавки, отдушки и красители. Даже в настоящее время при успешном развитии микробиологических и химических способов производства растения еще остаются источником тех соединений, производство которых еще слишком сложно, или дорого. Чаще всего основной интерес представляют продукты вторичного метаболизма растений. К веществам вторичного синтеза относят: алколоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др.
На выход вторичных продуктов в культурах растений клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологические и генетические регуляции синтеза вторичных метаболитов. Знание этих закономерностей позволяет регулировать процессы получения ценных веществ.
Питательные среды и особенности выращивания растительных клеточных культур.
В отличие от животной клетки, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. Существуют общие требования к выращиванию объектов in vitro. Это, прежде всего асептика, которая необходима и обязательна для культивирования, как отдельных клеток, так и каких-либо фрагментов ткани или органа растения (экспланта). Кроме того, для успешного культивирования клеток и тканей какой-либо культуры необходимо учитывать влияние физических факторов на рост и физиологические характеристики этой культуры на уровне фенотипа и генотипа.
Искусственные питательные среды, содержат ауксины: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг/л, в зависимости от вида экспланта. Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях происходит независимо от принадлежности растений к той или иной таксономической группе.
Методы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ.
Культура каллусных тканей, или культура тканей. Суспензионная культура. Культивирование отдельных клеток.
Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенные на твердой (агаразованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. Для производства биологически активных веществ (БАВ) используют каллусную ткань, которую получают твердофазной ферментацией и глубинным суспензионнным культивированием. Каллусная культура – это неорганизованная профилирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего начинается старение и отмирание клетки. Для того чтобы не произошло старения, первичный каллус через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.
Суспензионные культуры состоят из отдельных клеток, имеющих различную форму и размеры, и неоднородных многоклеточных агрегатов. Соотношение отдельных клеток и таких агрегатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения и условий культивирования. Глубинное культивирование осуществляют в колбах на качалках при частоте вращения 100-120 об/мин. В лабораторных условиях используют сосуды объемом 100-250 мл с небольшим объемом питательной среды. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда происходит остановка клеточного цикла в определенном периоде под воздействием химических (тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина) или физических факторов (создание условий «голодания» по одному из компонентов питательной среды).
Фазы ростового цикла в суспензионной культуре.
Ростовая кривая (модельная) имеет S-образную форму Различают следующие фазы ростового цикла:
- Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ.
- Экспоненциальная (логарифмическая фаза роста). Ограниченный период в ростовом цикле, когда происходит увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления.
- Линейная фаза. Очень короткая фаза ростового цикла. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянна.
- Фаза замедленного роста (ранняя стационарная фаза). В этот период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечается гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных веществ.
- Стационарная фаза. Культуральная среда истощается по наличию основных компонентов, необходимо проводить субкультивирование суспензионной культуры на свежую среду.
- Фаза деградации клеток. Метаболизм прекращается, так как энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию останавливают.
Промышленное выращивание клеточных культур и преимущества их использования.
Из сравнения каллусных и суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного метаболизма выше в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче осуществлять при работе с суспензионными культурами. Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделяют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выращивания через определенные интервалы времени производится отбор части суспензии и разбавление оставшейся суспензии свежей средой. Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы, свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии.
Преимущества использования клеточных культур заключаются в следующем:
ü Решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов растений, не поддающихся плантационному культивированию;
ü Возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.;
ü Имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением;
ü Возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами;
ü Имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.
Иммобилизация клеток и тканей растений, получение вторичных метаболитов на их основе. Преимущества иммобилизованных растительных клеток перед традиционными способами культивирования. Система культура с плоской основой.
Система колончатой культуры
Новым подходом, направленным на увеличение выхода вторичных метаболитов, является иммобилизация клеток и тканей растений. Клетки помещают в определенные носители: альгинат кальция, агарозные шарики, трехмерные сетчатые структуры из нейлона и т.д. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные условия культивирования. Основные условия иммобилизации - выделение метаболитов в питательную среду и свободное их извлечение.
Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:
- Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате (Catharanthus roseus L., Digitalis lanata L.).
- Адсорбция клеток на инертном субстрате. Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli.
- Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана.
- Ковалентное связывание с другим инертным носителем, типа КМЦ (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы). В основном проводились эксперименты по иммобилизации клеток животных и микроорганизмов.
Клетки, иммобилизованные на плоской основе, имеют более высокий уровень синтеза вторичных метаболитов, однако горизонтальная конструкция при промышленном культивировании создает неудобства при работе и требует большей площади, что устраняется в системе колончатой культуры.
Биотрансформация. Биотрансформация стероидных
гликозидов на примере Digitalis lanata.
Довольно часто синтез метаболитов в суспензионной культуре останавливается на промежуточных этапах, не доходя до получения необходимого конечного продукта. В этом случае получение целевого продукта возможно, благодаря процессу биотрансформации, суть которого заключается в изменении промежуточных метаболитов с помощью культур других растений или клеток бактерий с целью получения биологической активности конкретной химической структуры. Хорошо изученной системой, на примере которой можно проиллюстрировать способность процесса биотрансформации повысить активность вещества, является превращение дигитоксина в дигоксин за счет реакции β -12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, содержащимся в клетках наперстянки Digitalis lanata L. Дигитоксин и дигоксин принадлежат к группе стероидов, известных, как «карденолиды», применяемые в медицине для лечения сердечных заболеваний.
Культура протопластов. Микроклональное размножение.
Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов 3 типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Отдельные клетки могут быть изолированы из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра с сортером или путем последовательных разбавлений. Более эффективны методы использования ткани-«няньки» или «кормящего слоя ».
Под воздействием электрического поля или с помощью полиэтиленгликоля протопласты могут сливаться друг с другом с образование двух видов новых клеток:ü Гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного родителя.
ü Гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих родителей.
Микроклональное размножение - метод, позволяющий от одной меристемы получить (регенерировать) достаточно большое количество новых растений, в том числе и в культуре in vitro.
Современное состояние и достижения в области биотехнологии лекарственных средств
на основе культур растительных клеток и тканей.
Россия занимает первое место в мире по промышленному производству культур клеток. В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве. В настоящее время в клинической практике используются лекарственные средства, полученные на основе каллусных и суспензионных культур клеток растений: шиконин (кожные заболевания), дигоксин (сердечно-сосудистые заболевания), берберин (кишечные расстройства), диосгенин (противозачаточное средство), панаксозиды (адаптогены, укрепляющие иммунитет).
Трансгенные растения. Методы получения. Трансгенные растения в фармакологии.
Трансгенными называются растения, в которых успешно функционируют гены (или ген), пересаженные из растений или животных других видов. Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК.Растения дают человечеству десятки тысяч природных продуктов, многие из которых представляют большую ценность для фармакологии и промышленности. Часто такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые продуценты важных биологически активных веществ (Перенос гена гиосциамин-6-b-гидроксилазы из белены (Hyoscyamus niger L.) в растения красавки (Atropa belladonna L.) превратил продуцент атропина в продуцент скополамина).
Во всем мире ведутся работы по созданию на основе трансгенных растений так называемых «съедобных вакцин», которые можно использовать для предупреждения опасных заболеваний человека. В Институте физиологии и биохимии растений СО РАН создается вакцина против СПИДА, гепатита на основе трансгенеза томата и огурца.