История культивирования животных клеток. Методики и подходы.
Представление о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару: "Пробуждение уверенности в том, что животные живут в двух средах - millieu exterieur (внешняя среда), в которой существует организм, и millieu interieur, в котором существуют тканевые элементы организма". Не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного также будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Позднее, в 1885 году, У. Ру показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике, а уже в 1897 г., Лёб поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. В настоящее время можно культивировать клетки практически всех тканей и органов человека, животных и растений.
Культивирование органов. История исследований в области культивирования органов и тканей. Основные методы культивирования органов.
В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы выделяют два направления культивирования животных клеток: - культуры клеток (культура уже разобщенных клеток) и культуры органов и тканей (органные культуры). В зависимости от соотношения с поддерживающим субстратом клеточные культуры делятся на: однослойные и суспензионные. Тканевая культура - это собственно культура тканей, гистокультура, состоящая из эксплантата и зоны роста. Органная культура - культура, в которой эмбрионы, зачатки органов, целые органы или эксплантаты поддерживаются таким образом, чтобы обеспечивает дифференцировку и /или сохранение структуры и/ либо функции в этих условиях. Основные этапы техники культивирования органов:
1. "Техника часового стекла" (Фелл, Робинсоном,1929);
2. Метод часовых стекол с агаровым сгустком (Вольф,Хафен, 1952);
3. Модифицированный метод Троувелла (Ласнитски, 1989).
Введение клеток в культуру, их происхождение. Характеристика клеток
культивируемых in vitro.
Культура, источником которой являются органы, эксплантаты или клетки, непосредственно извлеченные из организма (опухолевые клетки, образованные культивировавшимися клетками, введенными животным), называется первичной культурой. Пассированная культура - культура, подвергавшаяся переносу из одного сосуда в другой. Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными. Свойством "бессмертности" обладают в основном клетки, полученные из опухолей. Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими зрелыми тканями. Получение первичных культур клеток взрослых тканей и их размножение является сложной задачей, продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика.
Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформация — наследуемое (необратимое) изменение свойств культивируемых клеток, вызванное известными факторами, например, новым генетическим материалом, химическими агентами, облучением или неизвестными причинами. Трансформированные клетки способны расти в условиях, в которых геометрические характеристики, а именно отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Трансформация может быть или вирусной, или «спонтанной». Старение характерно для клеток, имеющих ограниченный потенциал пролиферации, то есть низкую плотность насыщения при идеальных условиях культивирования. Примером могут служить линии диплоидных клеток человека. Повышенная способность к росту трансформированных клеток означает, что трансформация преобладает над процессом старения. Известно, что феномен клеточного старения развивается по достижении клетками предела Хейфлика (Hayflick, Moorhead, 1961). Трансформированные клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает их преимущество в биотехнологии.
Питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам
и условиям культивирования клеток животных и человека.
Клетки после извлечения их из ткани или организма помещают в культуральную среду, которая должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Традиционно среда для культивирования состоит из питательных веществ и витаминов в забуференном солевом растворе. Ключевым компонентом является сыворотка животных, например, эмбриональная бычья сыворотка. Без такой добавки наибольшая часть культивируемых клеток не будут воспроизводить собственную ДНК и, следовательно, не будут пролиферировать.
Факторы, влияющие на скорость деления клеток в клеточной культуре.
Ведение клеточных линий требует постоянного увеличения количества клеток, поэтому выбор условий культивирования направлен на обеспечение максимальной скорости клеточной пролиферации. К условиям, способствующим размножению клеток, относятся их низкая плотность, невысокая концентрация Ca2+, присутствие ростовых факторов. Высокая плотность клеток (выше 105 клеток на 1 см2) и концентрация Ca2+ (300—1500 мкмоль); присутствие индукторов дифференцировки (гормоны, например гидрокортизон, фактор созревания глии, фактор роста нервов, ретиноиды; и полярные растворители, в частности диметилсульфоксид) способствуют прекращению клеточного деления и индуцируют дифференциpoвку клеток.
Основные системы культивирования клеток.
Существует две основных системы клеточных культур:
1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.
2. Проточные культуры - культура, в которой производится постоянное продвижение (поступление и выведение) жидкой фазы. Обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Суспензионные культурыв отличие от монослойных культур предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.
Культуры клеток можно культивировать:
1. В плоских флаконах (матрацах).
2. Во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.
3. В колонках на «микроносителях» (Van Werel, 1967), в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.
4. На трёхмерных подложках-носителях естественного или искусственного происхождения с целью пространственного формирования будущего клеточного трансплантата (с каффолд-технология).
Гибридизация животных клеток. Получение клеточных гибридов
в естественных и искусственных условиях.
Еще в начале ХIX века было высказано предположение, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, однако гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах XX века. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных.
Методы создания химер.
К методам создания экспериментальных химер относят:
Агрегационный метод(Тарковский, Минц, 1960-1962), позволяющий получать химеры не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.
Иньекционный метод (Гарднер, 1968), основанный на использовании эмбрионов на стадии бластоцисты и нашедший применение при получении межвидовых химер. Химерные животные не передают потомкам генетическую мозаичность. У них происходит расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются.
Механизм слияния клеток. Вещества, индуцирующие слияние клеток.
1 этап - сближение мембран соседних клеток и установление между ними тесного контакта. 2-й этап - выход гликопротеидов и обнажение липидных слоев мембраны.
3-й этап - образование мицелл. Начало 4-го этапа - слияние мембран, образование цитоплазматических мостиков. Для индукции слияния клеток используются вещества различной природы: ионы Са2+, полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай. К другим агглютинирующим агентам относятся лектины растений и антитела.
Клонирование животных. Методы трансплантации ядер.
Клонирование млекопитающих.
Перенос ядер соматических клеток довольно часто не совсем корректно называют клонированием. Перенос ядер соматических клеток – технология создания клетки, которая вдет себя как эмбриональная стволовая клетка (ЭСК), но содержит генетический материал, полученный от взрослой клетки. Процесс начинается с оплодотворенной яйцеклетки и соматической клетки, взятой от взрослого организма. Донор оплодотворенной яйцеклетки и донор соматической клетки не должен быть одним и тем же индивидуумом. Ядро оплодотворенной яйцеклетки удаляется и заменяется ядром соматической клетки. Соматическая клетка теоретически может быть любым типом клетки: от костного мозга до кожи. Яйцеклетка развивается в зиготу, а линия эмбриональных стволовых клеток образуется из бластоциста, как в случае развития любой линии ЭСК. Теоретически возможно имплантировать новую яйцеклетку с ядром соматической клетки в матку, и она разовьется в целостный организм (клон), полностью идентичный организму, от которого была получена соматическая клетка.
Перенос ядер соматических клеток интенсивно использовался при клонировании животных. В 1996 году родилась овечка Долли – первый успешный клон, произошедший от клетки взрослого организма. С тех пор с использованием этой технологии ученые клонировали тысячи особей крупного рогатого скота, мышей и других животных. Использование технологии переноса ядер соматических клеток имеет несколько ограничений. Животные, полученные методом клонирования, имеют высокий процент выкидышей на поздних сроках беременности и рождения детёнышей с врожденными дефектами, свидетельствующее о том, что клеточная трансформация не лишена недостатков.
Использование культуры клеток человека.
Фибробласты являются основным клеточным элементом среднего слоя кожи, основная функция которых синтезировать и ресоздавать межклеточное пространство. Фибробласты синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса и ферменты, с помощью которых они разрушают коллаген и гиалуроновую кислоту, а также синтезируют эти молекулы заново. После установления лимита Хейфлика и фактов, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют низкую экспрессию антигенов гистосовместимости и отсутствие онкогенных потенций, стало возможно использование культивируемых вне организма фибробластов человека для терапевтических целей. Возможность культивирования в достаточном объеме необходимых для практики фибробластов делает реальным их клинического использования. Было показано, что пересаженные аллогенные фибробласты оказывают непосредственное влияние на заживление ран и на эпителизацию (Ross, 1968; Coulomb et el., 1989; Шумаков и др., 2002). Для лечения глубоких ожогов в 1983 году (Bell et el.) предложил «дермальный эквивалент» (аналог живой дермы, искусственно созданный из коллагена и фибробластов). Впервые была успешно использована 3-дневная культура аллогенных фибробластов для закрытия раневых поверхностей у пациентов с ожогами (Саркисов, Алексеев, 1994). Дальнейшее развитие клеточных технологий привело к появлению отдельных клинических опытов по применению пересадки клеток при витилиго, невусах, буллезном эпидермолизе, лечении хронических язв, различного рода рубцов, при удалении татуировок (Kumahai et al., 1995; Oh et al., 2001; Озерская, 2002). Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.
Стволовые клетки.
Понятие «стволовые клетки» (СК) впервые появилось в России еще в начале прошлого века. В 1908 году великий российский гистолог, профессор военно-медицинской академии в Санкт-Петербурге А.А.Максимов (1874-1928), изучая процесс кроветворения, пришел к выводу об их существовании. А.А. Максимов назвал клетку – прародительницу всех клеток крови – стволовой. В отличие от обычных клеток, стволовые клетки способны делиться неограниченное число раз. Они также сохраняют способность дифференцироваться в специализированные клетки, хотя в настоящее время еще не до конца понятно, какие факторы направляют СК по тому или иному пути дифференциации при их созревании. В ходе клеточного деления из стволовых клеток возникают материнская и дочерняя клетки. Материнские используются для самоподдержания популяции, а дочерние либо «выходят» в камбиальную клетку, либо непосредственно в дифференцировку. Стволовая клетка сохраняет свойства ранних эмбриональных клеток – плюрипотентность, а камбиальная эту способность утрачивает и производит лишь региональные структуры. Обнаружить стволовые клетки можно с помощью специальных методов (иммуногистохимической техники).
Классификация стволовых клеток по способности к дифференцировке
и источникам выделения.
ü По способности к дифференциации СК классифицируют:
1. Тотипотентные клетки - способны формировать все эмбриональные и экстраэмбриональные типы клеток. К ним относятся только оплодотворенный ооцит и бластомеры 2-8 клеточной стадии.
2. Плюрипотентные клетки – способны формировать все клетки эмбриона. К ним относятся эмбриональные стволовые клетки, первичные половые клетки и клетки эмбриональных карцином. Плюрипотентные стволовые клетки были выделены из мозга, мышц, кожи, желудочно-кишечного тракта, роговицы глаза, сетчатки глаза, печени и поджелудочной железы.
3. Другие типы стволовых клеток – локализуются в сформировавшихся тканях взрослого организма (adult stem cells). Они варьируют по способности к дифференцировке от мульти- до унипотентных. Плюри (мульти -) потентность - способность стволовых клеток дифференцироваться в несколько типов клеток различных органов. Унипотентные стволовые клетки способны образовывать только один тип дифференцированных клеток. Это означает, что они могут давать только строго определенные типы конечных дифференцированных клеток.
ü По источнику выделения СК классифицируют:
1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – внутриклеточная масса раннего эмбриона (на этапе бластоцисты 4-7 недель развития).
2. Фетальные стволовые клетки – клетки зародыша на 9-12 неделе развития, выделенные из абортивного материала.
3. Стволовые клетки взрослого организма.
В настоящее время по современной классификации к стволовым клеткам относят тотипотентные клетки морулы, плюрипотентные клетки бластоцисты, из которых в эмбриогенезе формируются все ткани организма, и мультипотентные региональные герминативные клетки (Orkin, Morrison, 2002).
Терминология, применяемая в практике клеточных технологий.
Ранее считалось, что во взрослом организме стволовых клеток нет, и существуют они лишь в самом раннем периоде эмбрионального развития. Однако в 70-х годах прошлого века А.Я. Фриденштейн с соавторами обнаружили стволовые клетки в мезенхиме (строме) «взрослого» костного мозга; в дальнейшем их стали называть стромальными клетками.
Стромальные стволовые клетки (ССК) – мультипотентные стволовые клетки взрослого организма, образующие строму костного мозга (поддерживающую гемопоэз), имеющие мезенхимальное происхождение.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) – мультипотентные СК, дающие начало всем клеткам крови: эритроцитам, В-лимфоцитам, Т-лимфоцитам, нейтрофилам, базофилам, эозинофилам, моноцитам, макрофагам и тромбоцитам. Кроме костного мозга ГСК обнаружены в системнои кровотоке и скелетных мышцах.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) – мультипотентные региональные СК, содержащиеся во всех мезенхимальных тканях (главным образом в костном мозге), способные к дифференцировке в различные типы мезенхимальных тканей, а также в клетки других зародышевых слоёв.
Тканеспецифичные стволовые клетки – распологаются в различных видах тканей и в первую очередь, отвечают за обновление их клеточной популяции, первыми активируются при повреждении. Обладают более низким потенциалом, чем стромальные клетки костного мозга.
Искусственное оплодотворение. Создание линии эмбриональных стволовых клеток.
ЭСК получают из яйцеклеток, которые были оплодотворены в результате процесса оплодотворения in vitro (искусственного оплодотворения). Линии ЭСК человека очень слабые, и поэтому их создание требует большого искусства, т.к. они способны превращаться в более дифференцированные клетки. Дифференцировка предотвращается при культивировании на субстрате, который содержит эмбриональные фибробласты мыши (фидерные клетки) в присутствии коровьей сыворотки. Это является серьезной проблемой, так как в этом случае клетки могут быть загрязнены продуктами или вирусами, попавшими туда из клеток мыши и/или коровьей сыворотки. Стабильные клеточные линии ЭСК человека впервые получил американский исследователь Дж. Томсон с коллегами в 1998 г. (Thomson et al., 1998). Сегодня в лабораториях мира выделено около 150 линий ЭСК. В нашей стране эмбриональные стволовые клетки получены в 2003 г. в Институте биологии гена РАН и в Институте цитологии РАН.
Основные этапы в истории развития клеточных технологий для лечения человека. Осложнения при клеточной трансплантации.
Клеточные технологии находят свое применение в медицине, современный этап развития которых начался с 1968 г., когда впервые в мире больному лейкемией был пересажен костный мозг, взятый у его родственника (США). К настоящему времени этот метод стал практически безальтернативным способом лечения онкологических заболеваний крови. Современные клеточныетехнологии основываются на: клеточной трансплантологии - введение клеток в больной организм для его лечения, осуществляется с целью замещения нефункционирующей или дефектной ткани или клеточной популяции и тканевой инженерии - трансплантации культивированных клеток на биосовместимом носителе с целью восстановления поврежденной ткани, органа или создания их de novo. Клетки, используемые как в клеточной трансплантологии, так и в тканевой инженерии, могут быть собственными (аутогенными), донорскими (аллогенными) или взятыми у животного с предварительно подавленным иммунитетом (ксеногенными). Несмотря на активно развитие этой отрасли медицины, клеточная трансплантология сталкивается в клинике с целым рядом осложнений (образование опухолей, тканевая эмболия и т.д.).
Применение современных клеточных технологий в медицине.
В последние годы стали активно изучать СК как перспективный клеточный материал для трансплантации. Хотя термин «стволовая клетка» был введен в биологию в начале прошлого века, статус большой науки эта область клеточной биологии получила лишь в 90-х годах прошлого века. Плюри- и мультипотентность стволовых клеток делает их идеальным материалом для трансплантационных методов клеточной и генной терапии.
В настоящее время рассматриваются впечатляющие перспективы возможного применения уникальных свойств СК в клинической практике для лечения болезней как терапевтического, так и хирургического плана. Широко обсуждаются возможности применения СК в лечении переломов, остеодегенеративных заболеваний костей и суставов. Наибольший прогресс достигнут на сегодняшний день в исследованиях, связанных с перспективой использования СК для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, что объясняется наибольшей интенсивностью изучения данных технологий в кардиологии (Смоленинов и др, 2005; Шевченко, 2006).
Клетки при культивировании могут изменять свои свойства и превращаться из нормальных клеток в трансформированные, близкие по характеристикам к опухолевым (Riggi et al., 2006). Причины таких изменений могут быть самыми разнообразными, и молекулярные механизмы этого процесса неясны и по сей день. Вероятность перерождения возрастает при стимулировании размножения клеток (Caplan, Bruder, 2001; Caplan, Dennis, 2006). На практике это означает проведение более строгого контроля за клетками в культуре, включая их цитогенетический анализ.
Несмотря на определенные технологические, политические, морально-этические и финансовые трудности изучение биологии СК необходимо для глубокого понимания механизмов регенерации и поддержания гомеостаза организма, а применение СК имеет блестящие перспективы, и, несомненно, окажет самое серьезное воздействие на облик медицины будущего.