Многочисленными исследованиями ученых показано, что направленность биотехнологического процесса и показатели готовых продуктов или препаратов главным образом обусловлены составом питательной среды и свойствами микроорганизмов, используемых для их получения.
Лечебные и профилактические свойства кисломолочных продуктов и препаратов объясняются наличием в них не только достаточного количества клеток бактерий, но и метаболитами их жизнедеятельности, которые образуются в результате развития микроорганизмов.
Вещества, синтезируемые микроорганизмами, выполняют разную роль: одни необходимы для развития самих клеток, другие выполняют функции в управлении биотехнологическим процессом, третьи важны для формирования органолептических показателей кисломолочных продуктов, четвертые обусловливают лечебные или профилактические свойства конечных продуктов, а некоторые выполняют одновременно несколько функций. Лечебное действие штаммов определяется следующими свойствами: нетоксичность; устойчивость к веществам, присутствующим в желудочно-кишечном тракте (фенолу, желчи, поваренной соли, различным уровням кислотности); адгезивная способность; устойчивость к антибиотикам; антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам; продуцирование ферментов, витаминов, полисахаридов и др.
Характеристика штаммов по отношению к веществам, содержащимся в желудочно-кишечном тракте человека, косвенно обуславливает их способность сохранять жизнеспособность в организме человека.
Образование продуктов жизнедеятельности микроорганизмов зависит от рода, вида, подвида и даже свойств конкретного штамма бактерий, которые могут проявляться при оптимальных условиях развития.
К микроорганизмам, используемым для создания препаратов на основе пробиотиков, предъявляются следующие требования:
1. Штаммы должны быть выделены из организма человека или тех видов животных, для которых они предназначены.
2. Должны быть непатогенными и нетоксичными.
3. Должны обладать выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.
Антагонистическая активность микроорганизмов объясняется действием неспецифических и специфических факторов. К неспецифическим факторам относят: образование молочной, уксусной и других кислот; создание низкого окислительно-восстановительного потенциала за счет утилизации кислорода (что приводит к ингибированию развития аэробных микроорганизмов); конкуренцию за питательные вещества. К специфическим: образование антибиотиков, бактериоцинов (высокомолекулярные вещества с узким спектром антибактериального действия), жирных кислот с короткой цепью. Установлено, что штаммы, относящиеся к одному виду, могут отличаться друг от друга по антагонистической активности.
Сообщается, что получены штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis, способные продуцировать антибиотик низин. Штаммы Lactococcus lactis subsp. сremoris продуцируют диплококцин; Lactobacilus acidophilus – ацидолин, лактоцидин, лактобациллин; Lactobacilus bulgaricus – булгарин.
Известно, что наибольшее антагонистическое действие на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы оказывают молочнокислые палочки и бифидобактерии. Молочнокислые палочки и бифидобактерии проявляют антагонизм по отношению к ряду возбудителей желудочно-кишечных заболеваний – могут в значительной степени подавлять развитие гнилостных бактерий, стафилококков, энтерококков, палочек протея, патогенных и энтеропатогенных кишечных палочек, сальмонелл, грибов рода Candida.
4. Должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями.
5. При длительном использовании они не должны вызывать побочных эффектов.
6. Должны обладать колонизационным потенциалом, то есть сохраняться в пищеварительном тракте до достижения положительного действия (быть устойчивы к низким значениям рН, фенолу, желчным кислотам, NaCl, антимикробным соединениям, продуцируемым эндогенной микрофлорой; хорошо адгезироваться к эпителию соответствующих слизистых оболочек).
Установлено, что естественной формой существования в природе любых микроорганизмов является иммобилизированное состояние. Это означает, что 99,9 % бактерий в природе обитает в виде фиксированных к различным поверхностям микроколоний. Прикрепление микробных клеток к твердым поверхностям происходит в три этапа: на первом – за счет слабых взаимодействий осуществляется обратимая адгезия, второй этап заключается в неспецифической адгезии с помощью фимбрий и пилей, включая возникновение водородных и ионных связей; на третьем этапе происходит образование усиливающего адгезию внеклеточного материала (полисахаридов). Первые два этапа быстрые, третий - медленный, зависящий от биосинтетического потенциала микроорганизмов.
Установлено, что бифидобактерии, проходя через желудочно-кишечный тракт, могут колонизироваться на стенках кишечника. Адгезия происходит специфично для того макроорганизма, из которого они были выделены, и является очень важной характеристикой для положительного действия, оказываемого бифидобактериями и лактобациллами на организм человека. Предполагается, что адгезия осуществляется с помощью протеинов, полисахаридов клеточных стенок к специфическим рецепторам клеток в кишечнике. Поэтому штаммы бифидобактерий, применяемые в качестве пробиотических элементов в кисломолочных продуктах и препаратов для людей, должны быть выделены именно от человека.
7. Должны быть устойчивы к антибиотикам.
Установлено, что совместное применение антибиотиков и антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.
Антибиотикоустойчивость природных штаммов микроорганизмов является свойством, которое передается по наследству, а значит, зависит от генотипа и его устойчивости. В то же время для некоторых штаммов бактерий антибиотики могут выступать в качестве неблагоприятного фактора, который приводит к изменениям свойств бактерий. Устойчивость бактерий к антибиотикам является характеристическим признаком конкретного штамма микроорганизма.
8. Должны накапливать биомассу с высоким количеством жизнеспособных клеток: не менее 1 108-1 109 КОЕ в 1 см3.
9. Штаммы молочнокислых бактерий должны продуцировать преимущественно L(+) –изомер молочной кислоты.
Известно, что различные виды молочнокислых бактерий образуют из лактозы два оптических изомера L(+) и D(-) с преобладанием того или иного, а также рацемическую (оптически не деятельную) DL – форму молочной кислоты.
Научными исследованиями установлены различия в физиологической роли оптических изомеров молочной кислоты в организме человека. L(+) – молочная кислота, поступающая с кисломолочными продуктами, легко ассимилируется организмом, тогда как D(-) – молочная кислота гораздо хуже переносится организмом человека, так как она сначала преобразуется под действием фермента дегидрогеназы D-2 гидроксикислот и только после этого ассимилируется организмом человека. Причем скорость окисления D(-) – молочной кислоты существенно ниже, чем у L(+) - молочной кислоты. DL – молочная кислота – индифферентная для организма.
Установлено, что ферментные системы детей до шестимесячного возраста не обеспечивают рационального включения в обмен веществ (D) – молочной кислоты. Повышенное содержание (D) – молочной кислоты может вызвать аллергию как у детей, так и у взрослых, а в ряде случае привести к нарушению кислотно-щелочного равновесия, снижению рН при абсолютном или относительном избытке кислот, т.е. к развитию ацидоза кишечника.
По мнению некоторых авторов L(+) – молочная кислота играет важную роль в процессе обмена веществ, а также в синтезе некоторых веществ.
Соотношение двух форм молочной кислоты в смеси может быть различно для отдельных штаммов даже одного вида бактерий. Соотношение L(+) и D(-) изомеров молочной кислоты можно регулировать правильным подбором штаммов. Поэтому при определении физиологически отбираемых штаммов для пробиотических продуктов и препаратов следует учитывать конфигурацию молочной кислоты, образуемой бактериями в процессе развития.
10. Должны обладать стабильными характеристиками, как в клиническом, так и в технологическом плане.
11. Должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близких к таковым в кишечном тракте; при их культивировании in vitro (на питательных средах) для накопления биомассы следует создавать условия, максимально приближающиеся к условиям микроокружения просвета кишечника.
12. Должны иметь четкую физиолого-биохимическую и генетическую маркировку, как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации;
13. Целесообразно включать в состав заквасок с бифидобактериями лактазопродуктивные штаммы этих бактерий.
Известно, что часть людей страдает непереносимостью лактозы, связанной с генетически обусловленным дефицитом лактазы. Лактаза, или β-D- галактозидаза – фермент, расщепляющий лактозу в верхней части кишечника на глюкозу и галактозу, которые затем всасываются в кровь. При недостатке или отсутствии данного фермента гидролиз лактозы не происходит, она достигает толстого кишечника в нативном состоянии, где расщепляется под действием кишечной микрофлоры до образования органических кислот и углекислого газа. Накопление этих соединений способствует повышению осмотического давления, притоку в толстый кишечник жидкости, вызывая такие симптомы, как диарея, рвота, боли в животе.
Лактазная недостаточность бывает врожденной или развивается в результате острых хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также длительного лечения антибиотиками. Установлено, что бифидобактерии обладают крайне низкой β-галактозидазной активностью, что является одной из причин их слабого развития в молоке. Имеются сведения, что активизация роста бифидобактерий в молоке путем введения фермента β-галактозидазы или за счет высокой β-галактозидазной активности других заквасочных культур, связана с повышением собственной β-галактозидазной активности бифидобактерий. В таких условиях бифидобактерии приобретают способность накапливать из лактозы необходимые для своего роста соединения: глюкозу и олигосахариды. В этой связи культивирование бифидобактерий в молоке совместно с термофильным стрептококком, обладающим высокой β-галактозидазной активностью, приводит к положительному эффекту при получении кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами.