Установка "Приподнятый крестообразный лабиринт" предназначена для изучения поведения грызунов в условиях переменной стрессогенности (при свободном выборе комфортных условий) и позволяет оценить: уровень тревожности животного (по предпочтению темноты/света, боязни высоты, выраженности и динамике поведения "выглядывания"); симптомы неврологического дефицита; привыкание (habituation).
Согласно руководству по доклиническому изучению новых фармакологических веществ оценка поведения крыс и мышей в приподнятом крестообразном лабиринте входит в перечень исследований по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия изучаемого соединения (базовые тесты).
Нормальные животные предпочитают большую часть времени проводить в закрытых (темных) рукавах лабиринта. Анксиолитический эффект препарата оценивается по увеличению числа заходов в открытые (светлые) рукава и времени нахождения в них, без увеличения общей двигательной активности.
Крестообразная арена лабиринта должна быть приподнята - например, поставлена на тележку или подставку, которые обеспечивают подъем арены.
3. Методы исследования памяти у крыс.
Водный бассейн Морриса.
Водный лабиринт Морриса был предложен в 1984 году как метод для изучения пространственной памяти крыс. В настоящее время его используютдля оценки возрастных и патологических изменений (в том числе экспериментальных), эффектов лекарственных средств. Тест имеет несколько преимуществ: во-первых, грызунов не нужно обучать плаванию и они способны длительное время продержаться на воде. Тест основан на естественном стремлении животного выбраться из воды. Во-вторых, не требуется специальной мотивации вроде стресса, голода или жажды. В-третьих, есть возможность различения когнитивных процессов (обучения и памяти) и физических возможностей. Кроме того, не задействуется обоняние (которое очень сильно развито у крыс).
Крыса помещается в центр круглой емкости с водой, откуда может выбраться только на платформу, которая находится под водой и изначально невидима для животного. Емкость мысленно делят на четыре квадранта (в некоторых исследованиях добавляют две концентрических секции). Вода окрашивается,например, путем добавления сухого молока, диоксида титана, белой краски, и т.д. Температура воды - от 18 до 26 ° С, размеры бассейна — 0,8-2,20 м в диаметре, 0,25- 0,4 м уровня воды. Размеры платформы от 9х9 до 12х12 см, в случае круглой платформы — диаметром 9-12 см. Обычные здоровые крысы очень быстро учатся доплывать до платформы от любой точки бассейна. Параметры эффективности обучения: направление, латентный период нахождения платформы и траектория плавания, если платформа каждый раз размещается в другом месте.
Крысы способны быстро обучиться находить предмет, который они никогда не видели, слышали или обоняли за счет неподвижных меток на бассейне или интерьера лаборатории. Кроме статичной платформы, используемой в классическом варианте теста Морриса, есть также т.н. Atlantisplatform – платформа, которая появляется, если животное провело определенное время внутри зоны платформы. Платформа остается невидимой, так как располагается под поверхностью воды, но, наткнувшись на нее, крыса может выбраться из бассейна.
На прохождение теста влияют масса тела, физическое состояние и возраст животного. Кроме того, самцы лучше справляются с тестом, чем самки, что говорит не столько о физических возможностях, сколько о лучшем ориентировании в пространстве. Хотя в возрасте 6 месяцев различия исчезали. Хотя это может зависеть от гормонального статуса — низкий уровень эстрогена положительно влияет на ориентировку в пространстве и наоборот. Исследования на самцах показали циркадианные изменения во времени выполнения задания, которые, вероятно, связаны с значительными флуктуациями концентрации тестостерона в крови. Самки, получавшие инъекции тестостерона, справлялись с заданием лучше.
В целом крысы справляются с тестом лучше, чем мыши, во-первых, они лучше плавают, во-вторых, из-за мышиного тигмотаксиса, из-за которого мыши стремятся держаться преимущественно бортика бассейна. Хотя в других видах тестов существенных различий между мышами и крысами не наблюдается. Возраст животного также играет роль — отмечается, что способность к обучению с возрастом падает, так же, как падают способность удерживаться на плаву, исследовательское поведение и локомоторные навыки, которые необходимо отличать от когнитивных расстройств, которые могут присутствовать у старых животных.
Недостатки теста:
Некоторые исследователи рассматривают погружение в воду как стрессогенный стимул и считают нужным перед тестированием давать животным привыкнуть к водной среде. Но в этом случае в результатах теста можно усомниться. К тому же влияние стресса никогда нельзя игнорировать, даже если считать, что предварительное привыкание снижает его до приемлемого уровня.
Погружение в воду может быть некомфортной для животных, если она будет слишком холодной, например. Если это не контролировать, могут появиться респираторные, глазные и другие инфекции.
Хотя сам бассейн достаточно прост и дешев, обработка результатов требует видеозаписывающей системы и программного обеспечения.
Преимущества:
Обучение протекает быстрее, чем в других лабиринтах. Обучение 1 крысы занимает 1-2 минуты в день, в среднем животному требуется 5 попыток.
Результаты представляют собой точные и воспроизводимые данные о долговременной памяти, рабочей пространственной памяти и обучении.
Не требуется никакой подготовки (водной или пищевой депривации).
Вероятность того, что животные будут использовать обонятельные метки, как они это делают в сухих лабиринтах, отсутствует.
Бассейн Морриса адекватно используется при моделировании различных заболеваний, таких, как цереброваскулярная болезнь, нарушения развития мозга, метаболические нарушения, болезнь Альцгеймера и др. Кроме того, его используют для тестирования трансгенных мышей, что позволяет интерпретировать результаты теста как когнитивные и некогнитивные компоненты мутации.
Лабиринт Барнса.
Позволяет оценить обучение, рабочую и долговременную память.
Животное помещается на круглую открытую приподнятую над полом платформу. Ему предъявляется раздражающий стимул в виде яркого света,вентилятора или сильного шума (некоторые исследователи считают, что вентилятор является сильным стрессовым фактором, а яркий свет препятствует четкой записи видео). В ответ животное вынуждено выбирать убежище — 1 из 18 отверстий вокруг платформы. Размеры лабиринта: диаметр платформы — 92 см, цвет ее берется в зависимости от цвета животного (для автоматической обработки необходимо, чтобы животное хорошо выделялось на фоне). Платформа содержит 18-20 отверстий, каждое 5 см. диаметром, расположенных по краю платформы на расстоянии 7,5 см. Лабиринт приподнят на 105 см над полом. К одному или нескольким отверстиям подводится пластиковые туннели, соединенные с коробками, так, чтобы они не были видны с платформы. Вокруг платформы располагаются визуальные метки.
При первом предъявлении платформы животному демонстрируют туннель с коробкой. Насильно запихивать животное в туннель нельзя, т.к. это приводит в стресс его. Если животное оказывается в ней, действие раздражающего стимула прекращается. Животное остается в коробке 1-2 минуты. После предъявления платформу тщательно моют для удаления запахов. При тестировании животное помещают в центр платформы, замеряется время нахождения туннеля с коробкой и количество ошибок. Если животное не обнаруживает нужное отверстие за 3 минуты, экспериментатор перемещает его к нему на 1 минуту, после чего возвращает в клетку.
Недостатки метода:
Иногда фактор является недостаточно стрессовыми и животное продолжает исследовать лабиринт, либо садится около нужного туннеля, но не забирается в него. Соответственно, происходит переоценка ошибок.
Животное может не полагаться на пространственную память, а исследовать отверстия последовательно. Если лабиринт вымыт недостаточно хорошо, оно может руководствоваться обонятельными метками.
Преимущества:
Самым главным преимуществом этого лабиринта является то,что он гораздо менее приводит в стресс животное — неприятные стимулы, предъявляемые животному, являются менее агрессивными, чем в других лабиринтах.
Позволяет оценить обучение, рабочую и долговременную память.
Считается, что он больше подходит для мышей, чем водный лабиринт Морриса.
Применяется при оценке экспериментальных моделей расстройств ЦНС — ЧМТ, возрастных изменений, болезни Альцгеймера, стресса и т.д. Кроме того, он применяется при фармакологических исследованиях.
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования (ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского»)
«Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского»
Таврическая академия
Факультет биологии и химии
ОТЧЕТ
по научно-исследовательской практике
«Методики различного поведения у крыс»
Подготовила студентка 2 курса магистратуры
Факультета биологии и химии
Кафедры физиологии человека и
животных и биофизики
Коношенко Екатерина Витальевна
Симферополь 2017