Оформление и анализ результатов исследований




Тема 4

Анаэробное разложение (брожение)

 

Брожение − это анаэробный (происходящий без участия кислорода) метаболический распад молекул питательных веществ, например глюкозы. По выражению Луи Пастера, «брожение − это жизнь без кислорода». Большинство типов брожения осуществляют микроорганизмы − облигатные или факультативные анаэробы.

Термин «брожение» также используется в более широком смысле, для обозначения бурного ростамикроорганизмов в соответствующей среде. При использовании в этом смысле не делается различия междуаэробным и анаэробным метаболизмом.

Брожение часто используется для приготовления или сохранения пищи. Говоря о брожении, обычно имеют в виду брожение сахара (превращение его в спирт) с использованием дрожжей, но, к примеру, при производстве йогуртаиспользуются другие виды брожения.

Использование брожения человеком обычно предполагает применение определенных видов и штаммовмикроорганизмов. Вина иногда улучшают с использованием процесса взаимного брожения.

Молочнокислые бактерии подразделяют на 2 группы – гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии (например, Lactobacillus delbrückii) расщепляют моносахариды с образованием двух молекул молочной кислоты в соответствии с суммарным уравнением:

C6H12O6 = 2CH3CHOH-COOH

 

Гетероферментативные бактерии (например, Bacterium lactis aerogenes) ведут сбраживание с образованием молочной кислоты, уксусной кислоты, этилового спирта и CO2, а также образуют небольшое количество ароматических веществ − диацетила, эфиров ит. д.

При молочнокислом брожении превращение углеводов, особенно на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счёт водорода, получаемого от НАД-Н. Гомоферментативное молочнокислое брожение используется для получения молочной кислоты, при изготовлении различных кислых молочных продуктов, хлеба и в силосовании кормов в сельском хозяйстве. Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит при консервировании различных плодов и овощей путём квашения.

Молочнокислое брожение представляет собой разложение сахара под действием молочнокислых бактерий с образованием молочной кислоты. В общем суммарном виде его можно пред­ставить следующим уравнением:

С6Н12О6 = 2С3Н6О3 + 18 ккал.

 

Это брожение часто наблюдается в молоке и вызывает его скисание. Отсюда и получили свое название вид брожения, бактерии, вызывающие его, а также основной продукт броже­ния − кислота. Молочнокислые бактерии бывают шаровидной и палочко­видной формы. Они неподвижны, спор не образуют и являются факультативными анаэробами.

Различные виды молочнокислых бактерий в равных условиях продуцируют разное количество кислоты, что объясняется их неодинаковой кислотоустойчивостью. Палочковидные бактерии образуют больше кислоты, чем шаровидные (кокки).

Молочнокислые бактерии способны сбраживать только моно- и дисахариды и совсем не сбраживают крахмал и другие поли­сахариды, так как не выделяют соответствующих ферментов.

Некоторые из этих бактерий вырабатывают антибиотические вещества, действующие против возбудителей кишечных заболе­ваний.

Молочнокислые бактерии широко распространены в природе, они постоянно встречаются в почве, на различных растениях, на плодах и овощах, в молоке и т. д.

Наибольшее значение имеют следующие молочнокислые бак­терии: молочнокислый стрептококк, болгарская, ацидофильная, сырная, дельбрюковская, огуречная, капустная палочки и др.

Молочнокислый стрептококк − соединенные попарно или в короткие цепочки шаровидные бактерии. Лучше всего разви­ваются при температуре 30−35°С, их температурный минимум около 10°С. При брожении накапливают до 1% кислоты. Широко применяются для приготовления молочнокислых продуктов (простокваши, кефира, сметаны, творога и др.).

Болгарская палочка нередко образует длинные цепочки, вы­делена из болгарской простокваши. Представляет собой непо­движную, бесспоровую палочку. Наилучшая для ее развития температура 40−45°С, температурный минимум 20°С. В молоке образует до 3,5%-ной молочной кислоты.

Ацидофильная палочка получена из выделений кишечника грудного ребенка. Имеет температурный оптимум около 40°С, ми­нимальная температура развития 20°С. В молоке накапливает до 2,2%-ной молочной кислоты. Применяется для приготовления молочнокислых продуктов − ацидофилина и ацидофильного мо­лока.

Сырная палочка имеет температурный оптимум около 40°С, используется в сыроделии.

Дельбрюковская палочка представляет собой одиночные или собранные в короткие цепочки клетки, не образующие спор. Температурный оптимум 45°С. Образует в среде до 2,5%-ной кисло­ты. Применяется для промышленного получения молочной кислоты, а также в производстве хлебных заквасок.

Огуречная и капустная палочки развиваются при квашении овощей. Молочнокислое брожение имеет важное промышленное зна­чение. Оно применяется в производстве молочнокислых продук­тов, в хлебопечении, в процессах квашения овощей и силосова­ния кормов, при изготовлении кваса, в производстве молочной кислоты и т. д.

Молочнокислое брожение в хлебопечении позволяет предот­вратить развитие вредных бактерий в тесте, вызывающих кар­тофельную болезнь (тягучесть) хлеба, а также способствует улучшению вкусовых свойств хлеба.

Молочная кислота, образующаяся в результате этого бро­жения, придает особый вкус квашеным овощам и препятствует развитию гнилостных бактерий.

При маслянокислом брожении происходит процесс разложения сахара под действием бактерий в анаэробных условиях с образованием масляной кислоты, углекислого газа и водорода. Оно протекает по уравнению:

С6Н12О6 = С3Н7СООН + 2СО2 + 2Н2 + 20 ккал

 

В качестве побочных продуктов при этом получаются эти­ловый и бутиловый спирты, уксусная кислота и др. Такое брожение может протекать в молоке и молочных продуктах, придавая им неприятные вкус и запах, характерные для масля­ной кислоты. Маслянокислые бактерии, вызывающие это брожение, пред­ставляют собой перитрихиально жгутованные подвижные, спорообразующие палочки, температурный оптимум их развития находится в пределах 30−40°С. Они являются строгими анаэро­бами и могут размножаться только при полном отсутствии кислорода воздуха или при очень незначительном его содер­жании. Споры, образуемые маслянокислыми бактериями, весьма устойчивы к неблагоприятным воздействиям, выдерживают ки­пячение в течение нескольких минут и погибают только при длительной стерилизации. Располагаются они либо в середине, либо ближе к одному из концов клетки, придавая ей форму ве­ретена или теннисной ракетки.

Маслянокислые бактерии способны сбраживать как простые сахара, так и более сложные углеводы − крахмал, пектиновые вещества и другие, а также глицерин. Эти бактерии широко распространены в природе, находясь в почве, в иле озер, прудов и болот, в скоплениях различных остатков и отбросов, навозе, загрязненной воде, молоке, сыре и т. д. Вызываемое этими бак­териями брожение имеет важное значение в превращениях ве­ществ в природе.

В народном хозяйстве маслянокислое брожение может при­нести большой вред, так как маслянокислые бактерии способ­ны вызывать массовую гибель картофеля и овощей, прогоркание молока и вспучивание сыров, порчу консервов и т. д.

На маслянокислые бактерии подавляюще действует кислая реакция среды, поэтому там, где развиваются молочнокислые бактерии, выделяющие молочную кислоту, жизнедеятельность маслянокислых бактерий приостанавливается. Если же в заква­шенных овощах медленно накапливается молочная кислота, то они могут быть испорчены в результате размножения в них маслянокислых бактерий. Эти бактерии вызывают порчу пасте­ризованного молока, в котором исключено молочнокислое брожение, а также сырого молока при длительном хранении его на холоде, когда деятельность молочнокислых бактерий ослаблена.

Развиваясь во влажной муке, маслянокислые бактерии при­дают ей прогорклый вкус. Маслянокислое брожение находит практическое применение в производстве масляной кислоты, которая широко используется в технике.

 

Методика выполнения лабораторной работы

Цель работы: изучить процесс брожения как результат жизнедеятельности молочнокислыхи маслянокислых бактерий.

Материалы, реактивы,оборудование: микроскоп; бактериологические петли и пипетки; покровные и предметные стекла; спиртовка; термостат; батистовая салфетка; набор пробирок; фильтровальная бумага;метиленоваясинь; иммерсионное масло;бензин; молоко;кисло-молочныйпродукт; неочищенный картофель; мел; раствор Люголя; смесь спиртаи эфира (1:1);5%-ный раствор FeCl3; этиловый спирт; концентрированная серная кислота.

 

Опыт №1. Получение микроорганизмов процесса молочно-кислого брожения

Инокулятом для получения накопительных культур молочнокислых бактерий могут служить кисло-молочные продукты.

В качестве питательной среды используют стерильное молоко. В пробирку со стерильным молоком вносят 1 мл кислого молока или другого молочно-кислого продукта. Пробирку с посевом и контрольную (со стерильным молоком) ставят в термостат при 30−32 °С на 1−2 дня (при 20−25 0С на неделю). Затемотмечают по свертыванию молока характер роста микроорганизмов − образование сгустка (плотного, рыхлого, слизистого), газообразование.Далее проводят микроскопирование препарата фиксированных клеток,приготовленного из культуральной жидкости. Отмечают морфологические особенности бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и т.д.

Учитываяособенность субстрата (молока), препарат фиксированныхклетокготовят следующим образом: на обезжиренное предметное стекло из пробирки с помощью стерильной бактериологической петли наносят каплю культуральной жидкости, которуюравномерно размазывают покровным стеклом. Мазоквысушивают навоздухе, фиксируют (захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через пламя горелки) и одновременно обезжиривают смесью спирта и эфира (1:1) в течение 10 мин, которую наносят непосредственно на мазок. После испарения смесь наливают повторно. Высушенный мазок окрашиваютмегиленовым синим (фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки; наносят на стекло из пипетки раствор красителя; срок окрашивания колеблется от1 до 3 мин; в этот период краситель должен покрывать весь мазок, затем его смывают легкой струей воды, при этом смывается краситель, не адсорбированный микроорганизмами; потом препарат высушивают, осторожно промокая его фильтровальной бумагой).

 

Опыт №2. Получение микроорганизмов процесса маслянокислого брожения

Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерийв большую пробирку емкостью 50 мл помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайкой ложки мела, заливают водопроводнойводой (расстояние до пробки 2−3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80°Св течение 10 мин вводяной, после чего помещают в термостат при 37 °С.

Через 1−2 сут. в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Отличительной способностью маслянокислых бактерий является их способность накапливать в клетках запасное вещество − гранулезу, а также образовывать споры. При спорообразовании клетки утолщаются либо в середине, либо в конце клетки. После созревания спор гранулеза в клетках исчезает.

После 5−6 дней культивирования анализируют накопительную культуру. Для приготовления микроскопического препарата культуральную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробирки, вблизи ломтиков картофеля.

Для обнаружения в культуральной жидкости масляной кислоты проводят две качественные реакции.

1. В сухую чистую пробирку вносят 3−5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1−2 мл 5-%-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают. Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за появления масляно-кислого железа.

2. В сухую чистую пробирку вносят 3−5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1−2 мл 96%-ного этилового спирта, 1 мл конц. серной кислоты. После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах образовавшегося масляно-этилового эфира.

Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий на каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5−10 мин каплю конц. раствора Люголя, после чего накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гранулеза окрашивается в темно-коричневый цвет.

 

Оформление и анализ результатов исследований

 

1. Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий из кефира, кислого молока, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.

2. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.

В ходе изучения данной темы студенты научатся получать накопительную культуру молочнокислых и маслянокислых бактерий и закрепят методы исследования микробиологических объектов, необходимые для их профессиональной деятельности.

Контрольные вопросы

1.Что такое молочнокислое брожение и какое значение оно имеет для
молочнокислых бактерий?

2. Какую форму имеют клетки молочнокислых бактерий?

3. Какой тип питания и дыхания у молочнокислых бактерий?

4. Одинакова ли оптимальная температура развития различных молочнокислых бактерий?

5. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению молочнокислых бактерий и чем ограничивается развитие посторонней микрофлоры?

6. Каково практическое использование молочно-кислых бактерий?

7. Что такое маслянокислое брожение и каково его значение для маслянокислых бактерий?

8. Какую форму имеют клетки маслянокислых бактерий и образуют ли они споры?

9. Каков тип питания и дыхания маслянокислых бактерий?

10. Как обнаружить наличие в опыте маслянокислых бактерий и продуктов ихжизнедеятельности? Подтвердить уравнениями реакций.

11. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению маслянокислых бактерий?

12. Каково практическое использование маслянокислых бактерий?

13. Какие еще виды брожения вы знаете? Какой биологический смысл имеет процесс брожения для жизнедеятельности микроорганизмов?

 

[1, с. 118 143; 3, с. 85–95; 6; 7; 8; 9, с. 10 20; 12, с. 10 20]

 

 



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2018-01-08 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: