Лекция № 4.
Часть II.
МИКОЛОГИЯ.
ДРОЖЖИ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ.
Классификация дрожжей и дрожжеподобных грибов.
В основу классификации дрожжей положена их способность к спорообразованию. По этому признаку дрожжи делят на спорообразующие (или истинные дрожжи) и бесспоровые (или дрожжеподобные).
Исходя из этого, если дрожжи способны размножаться, как почкованием, так и спорообразованием, то дрожжеподобные грибы размножаются только почкованием.
По классификации 1954 года, предложенной Кудрявцевым, и основанной на культурально-биохимических свойствах чистых культур, дрожжи отнесены к классу грибов, образуя в нем порядок одноклеточных грибов. Это значит, что дрожжи – биологически самостоятельная группа простейших одноклеточных немицелиальных грибов, разделенных на три семейства:
1. Saccharomycetaceae – включает 17 родов, размножаются почкованием, способны образовывать аски;
2. Saccharomycodaceae – образуют споры в неблагоприятных условиях, клетки лимоновидной формы, в начале жизненного цикла размножаются почкованием, переходящим в бинарное деление;
3. Schizosaccharomycetaceae – образуют споры в неблагоприятных условиях, клетки палочковидной формы, размножаются бинарным делением.
Аспорогенные дрожжи по систематике отнесены к семейству Criptococcaceae, которое, в свою очередь, включает три подсемейства:
1. Criptococcoideae;
2. Trichosporoideae;
3. Rhodotoruloideae.
Более усовершенствованная классификация, не противоречащая уже приведенной, может быть представлена так:
Дрожжи отнесены к классу Ascomycetes,
порядку Endomycetales,
семейству Saccharomycetaceae.
Современная классификация дрожжей, основанная на гомологичности нуклеиновых последовательностей ДНК.
В разных определителях объем рода Saccharomyces сильно варьирует. Ван дер Вальт в определителе Лоддер различает 41 вид, среди которых есть диплоидные, гаплоидные и виды. В. И. Кудрявцев включает в род Saccharomyces только диплоидные дрожжи, выделяя гаплоидные виды в Zygosaccharomyces, а виды с автогамным половым процессом – в род Debaryomyces. Н. А. Красильников рассматривает виды, объединенные у Ван дер Вальта в Saccharomyces, в трех родах – Saccharomyces, Zygosaccharomyces и Torulaspora. Такое деление на роды с изменениями в составе видов поддержано в новой систематике. Согласно Д. Ярроу, в роде Saccharomyces оставлено 5 видов с преимущественно диплоидной вегетативной фазой: S. cerevisiae, S. kluyveri, S. exiguus, S. dairensis, S. servazzii.
Наиболее важными биохимическими признаками для классификации дрожжей считаются следующие: диссимиляция, ассимиляция и сбраживание углеводов, расщепление гликозидов и жиров, разложение желатины, ассимиляция различных источников углерода, ассимиляция нитратов, образование крахмалистых веществ, эфиров, липидов, кислот, каротиноидных пигментов, витаминов, потребность в ростовых веществах.
Так, например, по способности сбраживать отдельные углеводы, дрожжи делят на 4 бродильных типа:
I тип: мальтоза + сахароза –
II тип: мальтоза + сахароза +
III тип: мальтоза – сахароза +
IV тип: мальтоза – сахароза –
При этом внутри каждого типа выделено несколько подтипов:
I тип: мальтоза + сахароза –
1. Галактоза +
2. Галактоза –
II тип: мальтоза + сахароза +
1. Галактоза +
2. Галактоза –
III тип: мальтоза – сахароза +
1. Галактоза +
2. Галактоза –
3. Лактоза +
4. Лактоза –
IV тип: мальтоза – сахароза –
1. Галактоза +
2. Галактоза –
Такое подразделение носит непосредственное прикладное значение, а не исключительно исследовательское.
Существует, так же, классификация, в основу которой положены физиологические свойства дрожжей. Это касается потребности в витаминах, которые являются одними из наиболее важных биологически активных веществ, причисленных к т.н. «факторам роста»:
1 класс: требуется только биотин;
2 класс: требуется биотин и инозит;
3 класс: требуется биотин, инозит и пантотенат;
4 класс: требуется биотин, инозит, пантотенат и пиридоксин;
5 класс: требуется биотин и пантотенат.
Это основные признаки, по которым можно произвести предварительную микробиологическую характеристику различных культур пивоваренных, хлебопекарных и прочих, технологически значимых дрожжей.
Другие возможные характеристики имеют скорее технологическое значение.
Применительно к хлебопекарным и прочим дрожжам, существуют расовые различия, которые включают скорость роста (генеративную активность), устойчивость к технологическим средам, зимазную и мальтазную активность, температурный оптимум и другие свойства.
Так, например, в пивоварении используют два типа брожения – верховое (теплое) и низовое (холодное).
К верховым относят дрожжи Saccharomyces cerevisiae, а к низовым Saccharomyces carlsbergensis (по старой классификации).
Низовые функционируют при 6 – 10оС, вплоть до 0оС, а верховые – при 14 – 25оС. В конце брожения низовые образуют плотный осадок, а верховые – всплывают на поверхность, образуя «шапку».
Причина такого различия в том, что верховые способны образовывать небольшие цепочки, т.к. процесс почкования у них не всегда завершается отделением дочерней клетки. Выделяющиеся при брожении пузырьки газа, к которым клетки имеют повышенное сродство, поднимают такие цепочки на поверхность сусла. Низовые дрожжи отличаются более выраженным межклеточным сродством, поэтому легче отделяются от пузырьков СО2.
Кроме того, дрожжи подразделяются на пылевидные и хлопьевидные.
Хлопьеобразование или Флокуляция – это специфическое свойство каждого штамма дрожжей, которое передается по наследству и определяет способность этого штамма обратимо агрегировать, или агглютинировать, в различного размера флоккулы, или агломераты.
Это свойство обусловлено наличием на поверхности клеток неких адгезивных структур, обладающих большим или меньшим сродством друг к другу.
С технологической точки зрения, хлопьевидные и пылевидные дрожжи по-разному ведут себя в процессе сбраживания сусла. Чем выше способность к флокуляции, или, чем раньше образуются флоккулы, тем раньше дрожжи выходят из процесса брожения, а значит, тем меньше экстракта сусла они успевают сбродить. Пылевидные же дрожжи, дольше находятся во взвешенном состоянии и поэтому полнее сбраживают сусло. Однако хлопьевидные придают сброженному субстрату больший аромат, вместе с тем, приготовленное пиво обладает меньшей пеностойкостью.
Следует отметить, что агглютинация не только обратимый процесс, но и зависит от многих факторов, таких, как температура, рН, состав среды и других. Все же решающее значение имеют генетические факторы, определяющие строение клеточной оболочки.
И, конечно, именно расовые различия лежат в основе технологических предпочтений, учитывающих некоторые характерные тонкости конечного продукта и определяющих потребительские его свойства. Важным критерием при этом является адаптированность культурных рас к требованиям конкретной технологии и возможным ее изменениям.
Общие положения физиологии дрожжей.
В силу объективно сложившихся обстоятельств микробиология, как наука, сформировалась на начальных этапах изучения биологических аспектов пивоваренного производства. Археологические данные о том, что пиво варили еще 4000 лет до н.э. интересны сами по себе, однако о микробиологическом характере этого процесса узнали лишь около 200 лет назад. Заложенные Пастером теоретические и практические основы изучения микробиологии брожения получили впоследствии колоссальное развитие. Но даже сегодня огромное количество вопросов в биохимии и физиологии дрожжей, в оптимизации происходящих при брожении процессов, в изучении сопутствующей вредной микрофлоры пива, вина, кваса и других натуральных продуктов брожения, остаются не решенными.
В последние годы произошли глобальные изменения в индустрии производства натуральных алкогольных, слабоалкогольных и тонизирующих напитков.
Крупные компании объединились в международные концерны. Вместе с тем, в различных странах все большей популярностью доказывают свою жизнеспособность минизаводы с минимальной производительностью.
Не менее крупные изменения коснулись и организаций, занимающихся научно-техническими аспектами производства.
Значителен тот факт, что в многочисленных лабораториях была определена полная последовательность генома Saccharomyces cerevisiae, изучены проявления его деятельности, было определено, как работают дрожжи. Это, несомненно, внесло большой вклад в понимание процесса спиртового брожения и управление процессами образования вкусовых компонентов.
Сегодня решение задач по оптимизации технологических процессов, достижению высокой их эффективности и получению качественного готового продукта, является необходимым условием экономической жизнеспособности любого предприятия, независимо от объемов его производственных мощностей. По существу, любая из отраслей бродильных производств - это слияние усилий инженеров, биохимиков и микробиологов.
В этой связи среди биотехнологических проблем сегодня выделяют два принципиальных аспекта:
1. качество производственной культуры;
2. контроль и профилактика возможного микробного загрязнения.
Повсеместно основным субстратом для производства натуральных алкоголь содержащих напитков служит растительное сырьё, которое является естественной экологической нишей для огромного количества микроорганизмов. Доминирующими представителями этой микрофлоры, конечно же, являются грибы и бактерии разных таксономических групп. Находясь в определенных взаимоотношениях, друг с другом, они существенно различаются по морфологическим, биохимическим и физиологическим свойствам. Но все их объединяет, то обстоятельство, что в естественных условиях на используемом человеком растительном сырье они находят вещества, способные удовлетворить их жизнеобеспечивающие потребности.
Будучи вовлеченными в технологический процесс многие из них погибают. Но те из них, которые способны сохранять свою жизнеспособность неизбежно влияют на качество конечного продукта, как с экономической точки зрения, так и сточки зрения потребительских свойств. Несомненно, одни из них несут положительные свойства, другие – отрицательные.
В этой связи следует отметить, что еще за долго до начала научного подхода в изучении микробиологических основ брожения люди научились умело использовать особенности совместного сосуществования этих микроорганизмов. Даже сегодня существуют предприятия, которые чистым дрожжевым культурам предпочитают десятилетиями формировавшуюся микрофлору, приспособившуюся к климатическим и технологическим условиям данного предприятия, обосновавшись в своеобразных экологических нишах и оформившись в относительно стабильные биоценозы. В силу сложившегося, не без помощи человека, количественного доминирования и естественных антагонистических свойств эти микроорганизмы способны поддерживать в течение долгих лет постоянство качественного и количественного состава. В конечном итоге, это позволяет получать продукт, положительно отличающийся от огромного числа конкурирующих аналогов.
Дрожжи не способны сбраживать крахмал злаковых культур, в связи с чем зерно предварительно проходит стадию солодоращения, в ходе которой происходит модификация крахмала, а при затирании – гидролиз с образованием сбраживаемых сахаров. Так как солодоращение – это контролируемый процесс, подобный натуральному проращиванию, солодоращению может быть подвергнута любая злаковая культура. Но широкое применение ячменя для производства пива, кроме прочих его свойств, объясняется особыми свойствами его оболочек, образующих натуральный фильтрующий слой при фильтровании пива и ограничивающих развитие инфицирующих грибов на их поверхности.
Для солодоращения пригодны не все сорта ячменя. Помимо необходимых ботанических характеристик (отсутствие периода покоя и др.), важным свойством является содержание азота. Слишком низкий уровень аминного азота в сусле ограничивает рост дрожжей, однако чаще встречается проблема слишком высокого содержания в ячмене азота, превышающего уровень, необходимый для умеренной жизнедеятельности дрожжей. Избыток азота, особенно аминного, напрямую влияет на биологическую стойкость пива, связанную, прежде всего, с молочнокислыми бактериями.
Осеннее созревание ячменя и продолжительность солодоращения в течение всего года определяет и необходимость сушки зерна до 11%-ой влажности. Кроме сохранения жизнеспособности и недопущения перехода зерна в состояние покоя такая влажность предотвращает инфицирование микроорганизмами, особенно грибами.
Процесс солодоращения происходит в три этапа (замачивание, проращивание, сушка), каждый из которых может быть подвержен микробиологическому загрязнению. Так, например, замачивание происходит при интенсивном увлажнении, при средних температурах, с несколькими воздушными паузами. Влага, тепло и аэрация существенно стимулируют рост микрофлоры, неизбежно присутствующей на поверхности зерна. По окончании проращивания достигнутую влажность необходимо уменьшить до пригодной для хранения – 5%. При этом необходимо найти компромисс между требованиями к микробиологической стабильности и энергетическими затратами на сушку.
При затирании из солода извлекаются вещества необходимые для жизнедеятельности дрожжей. Наибольший интерес с микробиологической точки зрения представляют начало и конец операций, осуществляемых в варочном отделении. Например, особенности дробление солода, кроме прочего, предполагает минимальное пылеобразование, чем существенно снижается возможность микробной контаминации с пылью сопутствующего оборудования и инвентаря и, прежде всего, в бродильном отделении. Но источником инфицирования может стать рост микроорганизмов на скоплениях зерен и пыли в дробилках, особенно при предварительном увлажнении или обработке паром. В таких условиях способны к размножению спорообразующие бактерии родов Bacillus и Clostridium, но порчу пива могут вызвать продукты их метаболизма – например, масляная кислота, которая остается в готовом пиве.
Неотъемлемой частью пива является хмель, хотя в производстве напитка использовалось множество различных трав. Возможно, он занял это место благодаря тому, что пиво, сваренное с хмелем, характеризуется высокой микробиологической стойкостью. Точный механизм этого воздействия остается спорным, но по всей видимости α-кислоты ингибируют рост большинства бактерий, особенно Грам +.
Серьезные микробиологические требования предъявляются к технологическим процедурам, обеспечивающим быстрое охлаждение и достаточное аэрирование сусла. В частности, к чистоте теплообменника, к его герметичности, к стерильности трубопроводов, к стерильности поступающего для аэрации воздуха.
С микробиологической точки зрения стадия брожения наиболее интересна и важна. Источники контаминации при брожении могут быть самыми различными, но среди основных можно перечислить: сусло, воздух, засевные дрожжи, бродильные емкости, линии трубопроводов, контрольно-регулирующая арматура.
В большей или меньшей степени общими являются источники микробиологического загрязнения пива на всех последующих стадиях его производства:
дображивание;
осветление (фильтрование);
розлив (бочка, кег, банка, стекло, одноразовая или возвратная тара);
хранение;
отпуск пива в розлив.
Из сказанного следует, что при производстве пива на любой технологической стадии должны быть созданы условия, исключающие присутствие бактерий и диких дрожжей, ведущих к порче готового продукта. Природа этих организмов с их морфологическими и физиологическими особенностями позволяет им оказывать самое непосредственное влияние на ход и результаты технологического процесса в целом.
Как любая отрасль, использующая растительное сырье, спиртовое производство также сталкивается с проблемой посторонней микрофлоры в той или иной степени влияющей на качество производимого продукта. Картофель и зерно, как основное сырье, всегда содержат огромное количество микроорганизмов различных таксономических групп, исчисляемое миллионами жизнеспособных клеток на 1 г массы.
Экономический ущерб определяется главным образом фитопатогенной микрофлорой, заражение которой может происходить как на корню, так и в процессе переработки и хранения. В зависимости от имеющегося разнообразия факторов патогенности такие микроорганизмы способны поражать как наружные, так и внутренние слои картофеля и зерна, значительно изменяя тем самым их химический состав и технологические качества.
Однако эпифитная микрофлора, обильно заселяющая растительное сырье, заслуживает не меньшего внимания с точки зрения влияния на экономические и качественные показатели деятельности предприятия. Эту группу микроорганизмов представляют различные дрожжи и дрожжеподобные грибы, плесени в споровой и вегетативной стадии, молочнокислые и уксуснокислые бактерии. Значительная часть из них погибает на различных стадиях технологического процесса. Наибольшую опасность представляют термофильные факультативные анаэробы. Именно эти физиологические особенности позволяют сохранить жизнеспособность в течение всего технологического процесса и активно участвовать в процессе сбраживания спиртового сусла.
Не следует исключать и возможность попадания посторонней микрофлоры в сбраживаемый субстрат с водой и из воздуха производственных помещений.
Еще во времена Пастера спонтанное брожение собранного винограда казалось более странным, чем брожение пивного сусла. Пастеру пришлось доказать не только то, что дрожжи должны находиться в бродящей среде, но и то, что осенью дрожжи находятся на поверхности спелых виноградных ягод. Более того, многочисленными последующими исследованиями было установлено, что на поверхности спелой виноградной ягоды нашли благоприятную среду обитания микроорганизмы самых разнообразных таксономических групп. Формирование этого биоценоза происходит в период спелости и в значительной степени определяется насекомыми и воздушными потоками.
Наряду с различными видами дрожжевой и дрожжеподобной микрофлоры биоценоз виноградной грозди представлен плесневыми грибами, молочнокислыми и уксуснокислыми бактериями, а также типичными почвенными микроорганизмами. Было установлено, что дрожжей на гребнях относительно мало, и они находятся главным образом на плодоножке ягоды и в порах ее подушечки. На поверхности ягоды образуются небольшие скопления дрожжей, но в изобилии они скапливаются на уровне старых устьиц и вокруг разрывов.
Число видов дрожжей, обнаруженных на винограде и в бродящих суслах, очень велико. Однако давно известно, что Kl. apiculata и Sacch. ellipsoideus встречаются чаще других и считаются основными видами, ответственными за брожение. Но вмешательство других видов, например Sacch. oviformis, в нормальный процесс брожения нельзя недооценивать.
Дрожжи – это эукариотические одноклеточные организмы, на биохимическом уровне подобные всем эукариотическим клеткам. В последнее время эти организмы очень широко использовались как модели для изучения более сложных эукариотов – не столько из-за интереса к свойствам этого организма при промышленном брожении, сколько из-за легкости работы с ними, простоты их культивирования и достижений генетики по анализу полной геномной структуры. В результате обширных фундаментальных биологических исследований получена богатейшая информация по биохимии и молекулярной биологии дрожжевой клетки. Такого рода информация в значительной степени прояснила и механизмы поведения дрожжевой клетки в промышленном производстве продуктов их жизнедеятельности.
Будучи помещенными в жидкую питательную среду при температуре от 5 до 35ºС, дрожжевые клетки начинают размножаться, и продолжается это до тех пор, пока не будет исчерпано хотя бы одно из необходимых питательных веществ.
Дрожжевая клетка имеет сложное строение с дифференцированными и специализированными структурами для осуществления энергетических и конструктивных процессов на молекулярном уровне. Сегодня описано более 12 клеточных структур, названных органоидами клетки.
Главными составляющими клетки являются: клеточная оболочка, цитоплазма и ядро.
Клеточная оболочка формируется двумя слоями: клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Дрожжевая клетка полностью окружена клеточной стенкой с небольшим периплазматическим пространством между стенкой и цитоплазматической мембраной.
Дрожжевая клетка полностью окружена клеточной стенкой с небольшим периплазматическим пространством между стенкой и цитоплазматической мембраной. Стенка является крупной гетерогенной структурой с огромным числом промежуточных связей, на долю которой приходится более 30% сухой массы клетки. В стационарной фазе стенки состоят примерно из 40% маннанопротеина, 60% глюкана и 2% хитина. Стенка клетки не гомогенна, и ее можно разделить на два основных слоя. Внешний состоит преимущественно из маннанопротеина, а внутренний слой, расположенный сразу же за периплазматическим пространством, - из глюкана со следами хитина. Маннанопротеиновый слой может быть удален без потери клеткой своей формы. Это означает, что морфологическая структура клетки определяется именно глюкановым слоем, который тоже не однороден. С внешней стороны он представлен глюкановым слоем с β-1,6-связями, тогда как ближе к цитоплазме доминируют фибриллы β-1,3-глюкана. Эти фибриллы связаны с N-ацетил-глюкозаминными остатками хитина, образуя вещество с очень низкой степенью растворимости.
Определяя форму клетки и сопротивляемость физико-химическим факторам внешней среды, клеточная стенка позволяет клеткам выжить в неблагоприятных условиях, которые довольно часто возникают в результате технологических операций, производимых с бродящим субстратом. Кроме того, молекулярным строением клеточной стенки определяется одно из главных технологических свойств дрожжей – флокуляционная активность. Способность или неспособность к образованию флокул в значительной степени определяет возможность использования данной расы дрожжей в той или иной отрасли бродильных производств. В лагерном пивоварении это имеет особое значение. Низовые пивные дрожжи в конце брожения образуют группы клеток (флокуляты), которые легко отделяются от пива, что является одной из важнейших технологических характеристик. Если флокуляция происходит раньше, то главное брожение останавливается, а если позже, то время на дображивание будет потрачено впустую или придется идти на дополнительные затраты для сбора дрожжей другими способами.
Способность к флокуляции определяется свойствами внешней стороны клеточной стенки. Выделяют четыре таких свойства: заряд, гидрофобность, топография и присутствие лектиноподобных соединений. Перед взаимодействием "клетка-клетка" клетке необходимо преодолеть электростатические силы отталкивания. Слиянию клеток способствует высокая гидрофобность и гладкая поверхность клеток. Но для склеивания требуется взаимодействие между лектиноподобным белком и маннановой цепочкой на поверхности клеточной стенки. Непременным условием является также присутствие ионов Са2+.
Поведение клетки при флокуляции регулируется деятельностью нескольких генов – FLO-генов. Предполагается, что они кодируют лектиноподобные белки. Этот белковый продукт был обнаружен во внешнем маннанопротеиновом слое клеточной стенки, в периплазматическом пространстве, на цитоплазматической мембране и в эндоплазматической сети. Он является очень крупным белком, закрепленным на цитоплазматической мембране, содержащим 1536 аминокислот, и поскольку 800 из них линейны, этого достаточно, чтобы пересечь клеточную стенку, и действовать по всей ее поверхности.
Жизнедеятельность дрожжевой клетки – это процесс динамичный и крайне многосложный. Определяется он взаимодействием двух систем, одна из которых – клетка, отделена от другой – питательной среды – клеточной стенкой. Через нее две системы тесно взаимодействуют и влияют друг на друга. Во всем своем разнообразии такое взаимодействие проявляется в любом технологическом процессе, предусматривающем использование биомассы дрожжевых клеток.
Одним из таких проявлений является поведение клеточной популяции в сбраживаемом субстрате на разных этапах технологического процесса. Из чего следует, что успешность технологического процесса зависит не только от эффективного взаимодействия клетки с внешней средой, но и от взаимодействия друг с другом в условиях этой среды.
Примером межклеточного взаимодействия является способность, или неспособность, к хлопьеобразованию. В технологии это свойство обозначили терминами "пылевидность" и "хлопьевидность".
Пылевидные дрожжи в течение всего процесса брожения находятся во взвешенном состоянии и более или менее равномерно распределены в жидкой питательной среде. Только при полном сбраживании субстрата они оседают на дно, образуя плотный осадок. Происходит это ввиду того, что прекращается образование клетками углекислого газа, который поддерживал их во взвеси.
Хлопьевидные дрожжи в конце брожения слипаются в агломераты и либо оседают на дно, либо поднимаются на поверхность в виде "шапки".
Образовывать такие агломераты, или "флокулы", могут дрожжи, как верхового, так и низового брожения, однако характер флокуляции у них различается. Объясняется это видимо приоритетным сродством либо друг к другу, либо к заряженным пузырькам углекислого газа. По определению Европейской пивоваренной конвенции 1958 года флокуляция представляет собой обратимую агрегацию, или агглютинацию дрожжевых клеток.
Флокуляционная способность – это специфическое свойство каждого штамма дрожжей, передаваемое по наследству. Пивные дрожжи по этому признаку Гиллилендом сгруппированы в четыре класса:
1 класс – дрожжи диспергированы в сусле в течение всего периода брожения, остаются разделенными в виде отдельных клеток или образуют скопления менее 10 клеток;
2 класс – большую часть периода брожения остаются в суспензии в виде отдельных клеток, однако после сбраживания части экстракта начинают образовывать хлопья до 1000 клеток;
3 класс – флоккулируют в конце брожения, образуя хлопья из многих тысяч клеток, и оседают на дно в виде плотного осадка;
4 класс – флоккулируют на ранних стадиях брожения, т.к. дочерние клетки не отделяются от материнских.
В пивоварении используют как пылевидные дрожжи 1 класса, так и хлопьевидные 2 и 3 классов.
Кроме указанных выше различий считается, что в пиве, например, хлопьевидные дрожжи менее полно сбраживают субстрат и оставляют в сусле меньшую муть, но формируют более полный и гармоничный аромат, чем пылевидные.
Хлопьевидные дрожжи образуют больше гликогена и жирных кислот, но отличаются меньшей приспосабливаемостью.
Пылевидные дрожжи дают меньший прирост биомассы, но обладают высокой бродильной активностью и обеспечивают глубокое сбраживание сусла. Они мельче и легче хлопьевидных, образуют больше диацетила и высших спиртов, однако особенно подвержены автолизу.
При высоких температурах хлопьевидные дрожжи могут утратить способность к флокуляции и стать пылевидными. Видимо, высокие температуры ингибируют формирование наружных клеточных структур, обуславливающих агглютинацию. Влияние повышенной температуры обратимо, и после ее снижения клетки снова приобретают способность к флокуляции.
Интересно то обстоятельство, что добавление хлопьевидных дрожжей к пылевидным вызывает осаждение последних.
Определяя форму клетки и сопротивляемость физико-химическим факторам внешней среды, клеточная стенка позволяет клеткам выжить в неблагоприятных условиях, которые довольно часто возникают в результате технологических операций, производимых с бродящим субстратом. Кроме того, молекулярным строением клеточной стенки определяется одно из главных технологических свойств дрожжей – флокуляционная активность. Способность или неспособность к образованию флокул в значительной степени определяет возможность использования данной расы дрожжей в той или иной отрасли бродильных производств. В лагерном пивоварении это имеет особое значение. Низовые пивные дрожжи в конце брожения образуют группы клеток (флокуляты), которые легко отделяются от пива, что является одной из важнейших технологических характеристик. Если флокуляция происходит раньше, то главное брожение останавливается, а если позже, то время на дображивание будет потрачено впустую или придется идти на дополнительные затраты для сбора дрожжей другими способами.
Способность к флокуляции определяется свойствами внешней стороны клеточной стенки. Выделяют четыре таких свойства: заряд, гидрофобность, топография и присутствие лектиноподобных соединений. Перед взаимодействием "клетка-клетка" клетке необходимо преодолеть электростатические силы отталкивания. Слиянию клеток способствует высокая гидрофобность и гладкая поверхность клеток. Но для склеивания требуется взаимодействие между лектиноподобным белком и маннановой цепочкой на поверхности клеточной стенки. Непременным условием является также присутствие ионов Са2+.
Электронной микроскопией удалось установить структурные различия между флоккулирующими и нефлокулирующими клетками. Флоккулирующие клетки несут на своей поверхности фибриллы, которые не обнаружены у нефлокулирующих клеток. Удаление этих фибрилл приводит к потере флокуляционной способности культуры.
Несмотря на это, флокуляционная способность во многом определяется внешними факторами: составом среды, нормой введения семенных дрожжей, температурой, аэрацией.
Установлено, что сбраживаемые сахара, особенно мальтоза и сахар-сырец, задерживают флокуляцию до тех пор, пока концентрация их в сусле не снизится до критического уровня. Все факторы, способствующие увеличению в сусле сбраживаемых сахаров, отрицательно влияют на флокуляционную активность.
Флокуляции дрожжей способствует недостаток в среде факторов роста.
Факторы, ускоряющие размножение, как правило, затрудняют флокуляцию.
Чем больше дрожжей вводится в сусло, тем быстрее наступает флокуляция.
Влияние аэрации неоднозначно: слабая аэрация улучшает флокуляцию, а чрезмерная может снизить флокуляционную способность культуры.
Имеет значение и предварительная подготовка семенных дрожжей. Дрожжи из аппарата чистой культуры, а также хорошо промытые семенные дрожжи флоккулируют очень слабо.
Толщина клеточной стенки дрожжевой клетки около 150 нм. Она не только определяет форму клетки, но и активно участвует во взаимодействии клетки с внешней средой. Ее составом и физиологическим состоянием в значительной степени определяются процессы поступления в клетку питательных веществ и выделения продуктов обмена. Кроме того, здесь локализованы ферменты, осуществляющие вегетативное деление клетки.
Существенные изменения, которые клеточная стенка, как и вся клетка, претерпевает в процессе брожения, являются определяющими в поведении дрожжевой биомассы в сбраживаемом субстрате.
К внутренней поверхности клеточной стенки примыкает цитоплазматическая мембрана, толщина которой составляет 8 – 10 нм. Являясь полупроницаемой биологической мембраной, она играет решающую роль в регулировании обмена веществ клетки с внешней средой. Локализованные здесь специализированные транспортные системы, размер пор и другие факторы, зависящие от физиологического состояния клетки в целом, регулируют эффективность взаимодействия внутренней среды клетки с окружающим питательным субстратом.
Цитоплазма клетки представляет собой среду, в которой происходят основные биохимические процессы клетки, и через которую осуществляется связь между всеми субклеточными структурами. Реагируя на условия культивирования и состав питательной среды, чем определяется состояние клетки, цитоплазма может иметь аморфное, фибриллярное, ячеистое и гранулярное состояние. В аэробных условиях она однородна и не содержит включений. В анаэробных условиях в ней могут появляться и исчезать мелкие вакуоли и различные включения. Кроме того, состав и структура цитоплазмы могут меняться в разные периоды клеточного цикла.
Ядро, через цитоплазму, образует с клеткой взаимосвязанную и взаимозависимую систему. Именно в ядре происходят процессы на уровне генома, регулирующие и направляющие все жизнеобеспечивающие биохимические реакции клетки.
Ядро дрожжевой клетки, размером 0,5 – 1,5 нм, представляет собой четко дифференцированную структуру, отделенную от цитоплазмы двухслойной ядерной оболочкой.
Из числа наиболее важных органоидов клетки в цитоплазме в большом количестве представлены митохондрии, диаметром около 0,2 нм. В аэробных условиях они равномерно распределены по цитоплазме, а в анаэробных – сливаются в толстые тяжи на периферии клетки. В митохондриях сосредоточены энергетические процессы клетки и синтезируется АТФ.
Мельчайшими структурными элементами клетки являются рибосомы, играющие важнейшую роль в синтезе белков.
В цитоплазме клетки могут формироваться временные включения, называемые вакуолями. Появление их определяется фазой клеточного цикла и состояния клетки. Содержимое вакуолей представлено главным образом метахроматином (валютин), гликогеном и жирами. Они могут накапливаться в больших количествах как запасные вещества и при голодании быстро истощаются. Накопление в клетке валютина и гликогена обычно происходит параллельно.
Каждая клетка проходит ряд этапов, называемых клеточным циклом. В результате первого этапа происходит увеличение размеров клеток и клеточной массы – фаза G1. По достижении некоторого критического размера происходит синтез дочерней ДНК параллельно с началом формирования почки – S-фаза. После завершения синтеза ДНК начинается митотическое деление клетки, при котором хромосомы разделяются на две, одна из которых с необходимыми цитоплазматическими органоидами и включениями переходят в развивающуюся почку – М-фаза. Процесс завершается синтезом перегородки между материнской и дочерней клетками, и отделением вновь образовавшейся клетки. У некоторых дрожжей процесс деления не всегда завершается полным отделением клеток, в результате чего образуются различной длины цепочки. Процесс почкования может продолжаться в том случае, если состав питательной среды удовлетворяет необходимые физиологические потребности клетки. Если же запас питательных веществ достиг нижней критической точки, клетка переходит в стационарную фазу – фаза G0. Такие клетки характеризуются низкой скоростью обменных процессов и значительной устойчивостью к стресс-факторам. Технологически это явление используется при хранении семенных дрожжей в воде при низкой температуре.
Энергия, необходимая для проведения биосинтеза и контролируемой деградации полимерных компонентов клетки, образуется при распаде моносахаридов (в частности – глюкозы) и некоторых простых олигосахаридов.
В результате гликолиза (путь Эмбдена-Мейргофа) из 1 моля глюкозы образуется 2 моля пировиноградной кислоты (пирувата). Затем 1 моль пирувата при участии пируват декарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы преобразуется в 1 моль этилового спирта и 1 моль диоксида углерода. Данный путь включает как утилизацию, так и образование АТФ, давая чистый прирост АТФ в 2 моля на каждый моль перерабатываемой глюкозы, что отражает поглощение только около 4% аккумулированной в сахаре энергии. Такой неэффективный процесс спиртового брожения происходит до тех пор, пока концентрация сахара превышает 5 г/л.