Как и другие эукариоты, дрожжевые клетки способны к делению лишь определенное количество раз, и число делений определяется свойствами штамма (обычно около 20-30 генераций). Возраст клетки легко определяется по числу почечных рубцов. В настоящее время идентифицированы 12 генов, определяющих старение клетки, что позволило описать отличительные признаки, по которым можно описать их возраст. По мере старения клетка увеличивается в размере, клеточная стенка становится толще, а интенсивность метаболизма заметно падает.
Вероятнее всего, при правильном ведении культуры для пивоварения процесс старения клеток не столь принципиален, поскольку размножающаяся дрожжевая популяция всегда содержит около 50% новых дочерних клеток, которые еще не почковались (т.н. "девственные" клетки), 25% клеток с одним почечным рубцом, 12,5% - с двумя и 12,5% - с тремя и более рубцами. Очень немногие клетки при этом близки к гибели. Тем не менее безусловно, что при неблагоприятных условиях дрожжевые клетки могут погибнуть или подвергнуться автолизу на любой стадии роста, но даже при исключительных условиях клетки живут не вечно.
Киллер-факторы или зимоцины.
Некоторые штаммы дрожжей обладают способностью выделять белки токсичные по отношению к другим штаммам, но безвредные для самого продуцента. В цитоплазме таких киллер-штаммов две двойные переплетенные молекулы РНК, внутри которых присутствуют протеиназные оболочки, формирующие вирусоподобные частицы. Входящий в состав этой частицы L-геном кодирует структурирование вирусоподобной частицы, а М-геном – токсичный димерный белок и белок иммунитета. Saccharomyces cerevisiae продуцирует три различных типа киллер-факторов: К1, К2 и К28. К1 и К2 связываются с присутствующим в клеточной стенке β-1,6-глюканом, образуя канал через мембрану. Белок иммунитета предупреждает самоубийство клетки-киллера, связываясь с рецепторами ее клеточной стенки. Токсин К28 связывается с маннанопротеинами клеточной стенки и ингибирует в чувствительной клетке синтез ДНК. Некоторые штаммы, т.н. "нейтральные" не продуцируют киллер-факторы и не подвергаются их воздействию. В таких штаммах содержатся вирусоподобные частицы, но из М-генома синтезируется только белок иммунитета.
«Киллер-явление» широко распространено в дрожжах из естественной среды обитания и в коллекционных культурах, что представляет серьезный риск для предприятий, использующих чувствительные штаммы.
Обычно при брожении дрожжи-контаминанты или бактерии конкурируют с культурными дрожжами и, в худшем случае, с каждым повторным использованием семенных дрожжей при последовательных циклах брожения происходит увеличение их доли в популяции. Дрожжи-киллеры – это крайняя форма контаминации, убивающая чувствительные культурные дрожжи, после чего они становятся доминирующими в сбраживаемом субстрате.
Известны различные зимоцины, продуцируемые дрожжами разных родов, но в условиях пивоваренного и спиртового брожения наиболее вероятными штаммами дрожжей-киллеров являются собственно виды Saccharomyces. Вполне вероятно, что киллерный штамм Saccharomyces, недавно попавший на производство из окружающей среды, будет хорошо образовывать споры и его можно обнаружить путем селективной тепловой обработки. В противном случае существует не много шансов подобрать соответствующую селективную среду для раннего его выявления и выделения, и загрязнение не удастся обнаружить до тех пор, пока киллер не станет превалирующим и его можно будет выявить с помощью неселективной среды (например, благодаря иной окраске колонии или по изменению морфологии клеток). Путем переноса в культуры дрожжей определенных резистентных или даже киллерных факторов вполне возможно создать новые резистентные виды дрожжей, однако таких факторов настолько много, что получить новые штаммы с заданными свойствами крайне трудно. Кроме того, такая обработка может привести к изменению или утрате полезных свойств дрожжевой культуры, а с учетом современного негативного отношения к генной инженерии, применение подобных дрожжей становится коммерчески неоправданным.
Выводы.
По ходу процесса брожения могут быть выделены три основные стадии развития дрожжей, соответствующие в принципе традиционным микробиологическим представлениям – лаг-фаза, фаза роста и стационарная фаза.
Лаг-фаза – это время, когда количество клеток не увеличивается, а образование этилового спирта минимально. Семенные дрожжи обычно поступают от уже проведенного брожения, и задержка в их развитии (лаг-фаза) связана с необходимостью приспособления клеток к новой среде. Основными действующими факторами здесь являются глюкоза, кислород и гиперосмотический стресс, которые приводят к изменению модели экспрессии генов и структуры модели ковалентной модификации имеющихся белков. Энергия и углерод для осуществления метаболизма образуются в ходе гидролиза гликогена. Этот процесс стимулируется присутствием глюкозы в среде.
По мере приспособления семенных дрожжей к новой среде они начинают поглощать глюкозу и другие питательные вещества, переходя в другую фазу клеточного цикла – фазу роста. С истощением запасов глюкозы клетки переходят к утилизации мальтозы, а затем – мальтотриозы. Аминокислоты и азот сусла также последовательно поглощаются, что обеспечивается некоторым количеством переключений транспортеров и путей утилизации. Клеточный цикл повторяется до тех пор, пока он не прекратится из-за нехватки питательных веществ или какого-либо стресса. Эта фаза характеризуется активным преобразованием углеводов в этиловый спирт и двуокись углерода, а также продуцированием целого ряда летучих соединений, влияющих на вкусо-ароматические свойства конечного продукта. Проблемы неполного сбраживания возникают тогда, когда в сусле недостаточно усваиваемых соединений азота, витаминов и микроэлементов, необходимых для осуществления клеткой метаболических процессов.
В большинстве случаев рост дрожжевых клеток прекращается из-за нехватки ненасыщенных жирных кислот, эргостерина или доступного азота, и дрожжи переходят в стационарную фазу. В этой фазе наблюдается снижение транспорта сахаров и аминокислот через цитоплазматическую мембрану, в результате чего брожение постепенно прекращается. В идеальном случае в этой фазе сразу после завершения брожения клетки должны выделиться в осадке или шапке. Однако стрессовые воздействия могут привести к несвоевременному проявлению таких реакций, что влечет за собой разного рода технологические проблемы.
Многие расы культурных дрожжей утратили способность к спорообразованию. Это уменьшает опасность спонтанного появления в дрожжевых культурах нежелательных мутаций. В тех же случаях, когда путем гибридизации хотят получить новые штаммы с положительными свойствами, прибегают к искусственным способам, провоцирующим спорообразование у родительских клеток.