Устройство микроскопа. Виды микроскопии

ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

ВМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

1. В микробиологических лабораториях учебных заведений не разрешается работать с живыми патогенными микроорганизмами.

2. Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания растворами лизола или хлорамина, а также 70%-ными (по объему) растворами изопропилового или этилового спиртов.

3. Нельзя загромождать рабочее место посторонними предметами.

4. Все сосуды, содержащие реактивы и другие вещества, должны иметь этикетки или быть пронумерованы, чтобы их нельзя было перепутать.

5. Нельзя пробовать на вкус химические вещества и питательные среды.

6. Нельзя работать в лаборатории без спецодежды. В микробиологической лаборатории можно находиться только в белом халате.

7. По окончании работ в лаборатории дежурный и руководитель перед уходом обязаны проверить, закрыты ли все газовые и водяные вентили, потушены ли спиртовки, выключены ли электронагревательные приборы и вентиляция, убраны ли горючие вещества.

8. Работа под вакуумом должна производиться в очках, стеклянные сосуды должны быть защищены экранами или обернуты полотенцем.

9. Проводить операции с нагревом, при которых используются кислоты или щелочи, следует только в очках.

10. По окончании работы привести рабочее место в порядок.

11. Не оставлять в открытом состоянии реактивы, едкие щелочи и кислоты.

12. Сдать в мойку лабораторную посуду или вымыть её самому.

13. Нельзя находиться в небольших помещениях (боксах) при включенной бактерицидной лампе.

14. Не разрешается в лаборатории курить, хранить и употреблять еду, напитки, жевательную резинку.

15. К работе с автоклавом и другими сосудами под давлением допускаются только подготовленные лица!

Тема 1

Устройство микроскопа. Виды микроскопии

 

Цель работы: изучить устройство светового биологического микроскопа и освоить правила работы с ним. Ознакомиться с различными видами микроскопии.

Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; бактериологические петли; предметные стекла.

 

1.1 Устройство микроскопа

 

Микроскоп (от греч. micros – малый и scopio – смотрю) – это оптический прибор, состоящий из двух частей: механической (подсобной) и оптической (главной).

1. Оптическая часть: окуляр, объектив, конденсор Аббе, осветительный прибор (зеркальце).

2. Механическая часть: штатив, подставка, предметный столик, тубусодержатель, макровинт, микровинт (рис. 1).

Рис.1. Устройство микроскопа

1 – основание, 2 – осветитель, 3 – светофильтр, 4 – конденсатор Аббе, 5 – предметный столик, 6 – объективы, 7 – револьверная головка, 8 – монокулярная насадка, 9 – окуляр, 10 – штатив, 11 – измеритьельный нониус, 12 – ограничительный винт, 13 – держатель препарата, 14 – ручка грубой настройки, 15 – ручка точной настройки, 16 – рукоятка перемещщенния конденсатора.

Механическая часть микроскопа.

Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме дуги. К нему примыкают коробка ме­ханизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов.

Макрометрический винт (кремальера, зубчатка, макро­винт) служит для предварительной ориентировочной установ­ки изображения рассматриваемого объекта.

Микрометрический винт (микровинт) используют для по­следующей четкой установки на фокус. При полном повороте микровинта труба передвигается на 0,1 мм (100 мкм).

При вращении винтов по часовой стрелке труба опуска­ется по направлению к препарату, при вращении против часо­вой стрелки – поднимается от препарата.

Предметный столик служит для размещения на нем пре­парата с объектом исследования. Предметный столик вращает­ся и перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре столика находится круглое от­верстие для освещения препарата снизу лучами света, направ­ляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) – пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления препарата.

Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская пропусков (что важно при подсчете), или же если во время работы требуется повторное исследование какого-либо определенного участка на препарате, на предметный столик по­мещают препаратоводителъ. На нем имеется система линеек – нониусов, с помощью которых можно присвоить координаты любой точке исследуемого объекта. Для этого при установке препаратоводителя следует совместить центр вращения столи­ка и оптическую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя (отсюда предметный столик с препаратоводителем называют иногда крестообразным).

Тубус (труба) – оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней части тубуса при­крепляется револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклон­ный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика.

Оптическая часть микроскопа состоит из основного оп­тического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осве­тительной системы (зеркало и кондесор). Все части оптиче­ской системы строго центрированы относительно друг друга.

Во многих современных микроскопах зеркало и конден­сор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источ­ником света.

Осветительная система находится под предметным сто­ликом. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая – вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться только плоским зер­калом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конден­сора с объективами малых увеличений. Конденсор (от лат. соп-denso– уплотняю, сгущаю), состоящий из 2–3 короткофокус­ных линз, собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим прежде всего при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механиз­мом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз спе­циальным винтом. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоя­щая из стальных серповидных пластинок.

Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные – при умень­шенном отверстии диафрагмы.

Под конденсором располагается кольцевидный держатель для светофильтров (обычно к микроскопу прилагаются синее и белое матовые стекла). При работе с искусственным источ­ником света светофильтры создают впечатление диезного ос­вещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.

Объектив (от лат. objectum– предмет) – наиболее важ­ная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечи­вает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выпол­няют преимущественно функции коррекции оптических не­достатков, возникающих при исследовании объектов.

Один из таких недостатков – явление сферической абер­рации. Оно связано со свойством линз неравномерно пре­ломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, и поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В ре­зультате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.

Хроматическая аберрация возникает при прохождении че­рез линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломля­ясь по-разному, лучи пересекаются не в одной точке. Си­не-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.

К объективам, устраняющим сферическую и частично хроматическую аберрацию, относятся ахроматы. Они содержат до 6 линз и коррегируют первичный спектр (желто-зеленую часть спектра), не устраняя вторичного спектра. Изображение, получаемое с помощью ахроматов, не окрашено, но края его имеют красный или синеватый ореол. В современных ахрома­тах этот недостаток практически неуловим. Лучший материал для линз ахроматов – флинтгласы – старые сорта стекла с вы­соким содержанием окиси свинца.

Объективы, устраняющие хроматическую аберрацию и для вторичного спектра, называют апохроматами. В их со­ставе может быть от 1 до 12 линз. Линзы апохроматов для луч­ей коррекции вторичного спектра делают из плавикового пата, каменной соли, квасцов и других материалов. Апохроаты дают возможность устранить окрашивание объекта и по­лучить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета. Максимального эффекта при работе с апохроматами можно достичь только при их сочетании с компенсационными окуля­рами, возмещающими оптические недостатки объективов. В компенсационных окулярах хроматическая ошибка противо­положна хроматической ошибке объектива, и в результате хро­матическая аберрация микроскопа оказывается почти полно­стью компенсированной.

Планахроматы – разновидность апохроматов, имеющих плоское поле зрения. Объективы-планахроматы полностью устраняют искривление поля зрения, обуславливающее нерав­номерность фокусировки объекта (при кривизне поля зрения фокусируется только часть поля). Планахроматы и планапохроматы используют при микрофотографии.

Объективы бывают сухие и погружные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. Опти­ческий расчет иммерсионных объективов предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в жид­кую однородную среду. При работе с сухим объективом вслед­ствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя (рис. 2).

Рис. 2.Ход лучей в су­хой и иммерсионной системах: I–V – лучи света

 

При работе с иммерсионным объективом необ­ходимо поместить между покровным стеклом и линзами объектива кедровое масло показатель преломления кото­рого близок к показателю преломления стекла (табл. 1).

Таблица 1

Показатели преломления некоторых соединений

Вещество	Показатель
Воздух	1,00
Стекло	1,52
Вода	1,33
Глицерин	1,47
Касторовое масло	1,48–1,49
Льняное очищенное осветленное масло	1,491–1,486
Кедровое масло	1,515
Смесь касторового масла с гвоздичным (жидкость Мера)	1,515
Гвоздичное масло	1,53
Канадский бальзам	1,536
Анисовое масло	1,557
Монобромнафталин	1,658

 

Величина увеличения объективов обозначена на их оп­раве (8х, 40х, 90х). Каждый объектив характеризуется, кроме того, определенной величиной рабочего расстояния в милли­метрах.

У объективов с малым увеличением расстояние от фрон­тальной линзы объектива до препарата больше, чем у объекти­вов с большим увеличением. Так, объективы с увеличением 8х, 40х и 90х имеют соответственно рабочие расстояния 13,8; 0,6 и 0,12 мм. В зависимости от того, с каким объективом ра­ботаешь, для его фокусировки выбирается макрометрический и микрометрический винт. Иммерсионный объектив имеет рабочее расстояние до объектива 0,12 мм, поэтому его нередко называют «близоруким».

У объективов малых увеличений не только большие ра­бочие расстояния, но и большие поля зрения. В связи с этим рекомендуется исследование препарата начинать с помощью объектива с небольшим увеличением.

Объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной 0,17 ± 0,1 мм. Если стекло не соответствует стандар­ту, необходимо регулировать объектив вращением кольца коррекционной оправы, которой оснащены современные высоко­качественные объективы. При отсутствии такой оправы сфери­ческую аберрацию, вызываемую покровным стеклом, следует устранить, поднимая или опуская тубус микроскопа.

Одна из важных характеристик объектива – разрешаю­щая способность, обуславливающая в конечном итоге разре­шающую способность микроскопа в целом. Она определяет наименьшее расстояние между двумя точками на препарате, при котором их изображение будет раздельным.

Окуляр (от лат. ocularis– глазной) служит непосредст­венным продолжением «линз» (хрусталиков) глаз человека. Преломляющую систему глаза можно рассматривать как дво­яковыпуклую линзу со средним фокусным расстоянием 15 см (расстояние наилучшего зрения 25 см).

Окуляр состоит из двух линз – глазной (верхней) и поле­вой, или собирательной (нижней), заключенных в металличе­скую оправу. Назначение полевой линзы – собирать лучи, идущие от объектива, таким образом, чтобы они проходили че­рез маленькое отверстие глазной линзы.

Назначение окуляра – прямое мнимое увеличе­ние действительного обратного и увеличенного изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра выгравировано на его оправе. Рабочее увеличение окуляров колеблется в пределах от 4хдо 15 х. Собственное увеличение окуляра вы­числяют по формуле, применяемой для определения увеличе­ния луп

 

K = L/F,

где L – расстояние наилучшего зрения, равное 25 см;

F– фокусное расстояние линз окуляра.

 

Окуляры бывают различных типов. Выбор их зависит от объектива. С ахроматическими объективами малых и средних увеличений и планахроматами малых увеличений применяют окуляры Гюйгенса или ортоскопические окуляры; с апохроматическими, планахроматическими и ахроматическими объектива­ми больших увеличений – компенсационные окуляры.

Окуляры Гюйгенса состоят из двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклой стороной к объективу. Нижняя линза обычно имеет больший диаметр и большее фокусное расстоя­ние, чем верхняя. Фокальная плоскость окуляров Гюйгенса располагается между глазной линзой и линзой поля зрения.

При длительной работе с микроскопом следует пользо­ваться двойными окулярами – бинокулярной насадкой. Биноку­лярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5х) и снабжены коррекционными линзами. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55–75 мм в зависимости от рас­стояния между глазами наблюдателя. Работа с бинокулярной насадкой улучшает видимость объекта, снижает яркость изо­бражения и тем самым сохраняет зрение. Технические характеристики микроскопа представлены в таблице 2.

 

Таблица 2

Технические характеристики микроскопа

Характеристики	Значение
увеличение микроскопа	от 40х до 100х; (до 1600х)*
Объетивы	4х, 10х, 40х, 100х ми
окуляры	10х, (16х*)
Конденсатор	системы Аббе с ирисовой диафрагмой
Осветитель	220 вольт/20 ватт
Вес	3кг
Габариты	140×190×330 мм

* Увеличение до 1600х – дополнительная опция, при заказе изделие комплектуется окуляром 16х

 

1.2 Работа с микроскопом

 

Основные правила работы с микроскопом. Место для микроскопа выбирают подальше от прямого солнечного све­та. Работа на столе с темной поверхностью меньше утомляет глаза.

Лучше смотреть в окуляр левым глазом, не закрывая пра­вого. В случае работы с бинокулярной насадкой сначала регу­лируют расстояние между окулярами в соответствии с расстоя­нием между глазами наблюдателя так, чтобы поля зрения обо­их окуляров слились в одно.

Переносить микроскоп необходимо двумя руками: одной держать штатив, другой – основание микроскопа. Следует предохранять микроскоп от толчков, соприкосновения с силь­нодействующими веществами (кислотами, щелочами и т. п.).

Не рекомендуется вынимать окуляр из трубы, чтобы не загрязнять пылью трубу и объективы.

Линзы должны быть всегда чистыми. Нельзя касаться пальцами оптических поверхностей.

Микроскоп следует хранить в чехле.

Работа с иммерсионной системой микроскопа. При рабо­те с иммерсионным объективом (V = 90*; А = 1,25) необхо­димо установить зеркало плоской стороной вверх и поднять конденсор.

Каплю иммерсионной жидкости (кедрового масла) нано­сят на препарат, не размазывая ее по стеклу. Погружать в им­мерсионную жидкость можно только иммерсионные объекти­вы (не сухие!).

Глядя сбоку на предметное стекло, опускают объектив до поверхности масляной капли. Далее, глядя в окуляр, осторож­но опускают объектив при помощи макровинта, следя за появ­лением изображения.

Когда изображение объекта появится, переходят к использованию микровинта. Если изображение нерезкое, тусклое или плывет – что-то сделано неправильно: загрязнена фронтальная линза объектива, мешают пузырьки воздуха в масле, случайно закрыта диафрагма, сдвинуты лампа или зеркало. Причину некачественного изображения надо устранить.

По окончании работы поднимают тубус, снимают препа­рат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива хлопчатобумажной салфеткой, смоченной очищенным бензином.

Иммерсионную жидкость (кедровое масло) рекомендуют хранить в специальных двухкамерных масленках. В наружную камеру наливают ксилол или очищенный бензин для очистки объективов от масла, во внутреннюю – кедровое масло. Каме­ру с маслом герметично закрывают пробкой, в которую вставляют стеклянную палочку для нанесения капли масла на препарат.

Установка освещения. Удобнее пользоваться искусственным источником света – он более постоянен, чем дневной, лучше освещает объект, что особенно важно при работе с объективами с сильным увеличением (90х).

Принцип Кёлера состоит в том, что освещение апертуры коллектора осветителя, конденсора и объектива должно быть одинаковым.

Последовательность установки света по Кёлеру следую­щая:

1)на расстоянии 25–30 см от микроскопа с помощью соединительной планки (крестовины) устанавливают освети­тель с низковольтной лампочкой;

2)препарат помещают на предметный столик, устанав­ливают объектив 8х, поднимают до упора конденсор, открыва­ют полностью его ирисовую диафрагму, почти полностью за­крывают полевую диафрагму осветителя, оставляя лишь не­большое отверстие (1,0–1,2 см в диаметре), отодвигают матовое стекло и ставят плоское зеркало;

3)включают осветитель, устанавливают яркость света та­ким образом, чтобы нить лампы не давала слишком большого накала (это вредно для глаз). На зеркало помещают белый лист бумаги и фокусируют на него изображение нити лампы осве­тителя;

4)глядя в окуляр, движением зеркала проектируют све­товой поток в поле зрения микроскопа, фокусируют препарат, опуская конденсор и улавливая изображение полевой диафраг­мы осветителя в виде светлого круглого пятна. С помощью зеркала надо добиться того, чтобы световое пятно попало в центр поля зрения. Чем больше отверстие диафрагмы осве­тителя, тем больше световое пятно. Если оно занимает боль­шую часть поля зрения, его следует уменьшить, сузив отвер­стие диафрагмы (делать это надо смотря в окуляр);

5)наблюдая в микроскоп, фокусируют препарат в об­ласти светового пятна, продолжая слегка опускать конденсор. Если все сделано правильно, то световое пятно, видимое од­новременно с препаратом, должно быть равномерно освеще­но. В противном случае следует слегка повернуть корпус осве­тителя;

6)продолжая смотреть в окуляр, открывают диафрагму осветителя до тех пор, пока световое пятно не займет все поле зрения. Лучше, если освещенный круг немного выйдет за пре­делы поля зрения.

Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют. Диафрагмой конденсора пользуются только при смене объективов.

Установку света по Кёлеру рекомендуют также и при темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Измерение объектов. Измерять клетки микроорганиз­мов (в мкм) можно на фиксированных и живых препаратах с помощью шкалы окулярного микрометра – окулярной ли­нейки. У кокков определяют диаметр клеток, у бактерий дру­гой формы – длину и ширину.

Окулярная линейка – круглая стеклянная пластинка, по­средине которой нанесена шкала делений (50 или 100 делений) общей длиной 5 мм. Вставляют окулярную линейку шкалой вверх на диафрагму окуляра, предварительно вывинтив линзу окуляра. Затем ставят препарат и определяют, скольким делениям линейки соответствует длина и ширина клетки. Измеря­ют не менее 10–20 клеток.

Чтобы рассчитать истинные размеры клеток, определяют иену деления окулярной линейки с помощью объектного мик­рометра. Последний представляет собой металлическую плас­тинку в форме предметного стекла с отверстием в центре; в от­верстие помещено стекло с линейкой (шкала из 100 делений). Общая длина шкалы объектного микрометра – 1 мм, величи­на одного деления – 10 мкм (0,01 мм).

Для определения цены деления окулярной линейки объ­ектный микрометр помещают вместо препарата на столик микроскопа и фокусируют изображение линейки при малом увеличении. Затем линейку перемещают в центр поля и меня­ют объектив на тот, при котором измеряли клетки. Передвигая столик микроскопа и поворачивая окуляр, устанавливают объ­ектный и окулярный микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна перекрывала другую. Определение цены деления окулярного микрометра проводят по принципу нони­уса, т. е. совмещают одну из черт шкалы окулярного микро­метра с чертой объектного микрометра и находят следующее совмещение. Допустим, в двух делениях объектного микромет­ра (20 мкм) умещается пять делений окулярного микрометра, тогда одно деление окулярного микрометра при данном увели­чении равняется 4 мкм (20: 5). Зная, скольким делениям оку­лярной линейки соответствует длина и ширина изучаемых кле­ток, умножают цену деления окулярного микрометра на эти числа.

Полученные значения цены делений окулярной линейки справедливы только для данной системы окуляр – объектив.

Виды микроскопии

Основными характеристиками микроскопа являются общее увеличение и разрешающая способность.

Общее увеличение не характеризует качества изображения, которое может быть четким и нечетким.

Четкость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. той наименьшей величиной объектов или их деталей, которые можно увидеть с помощью этого прибора. Разрешающая способность зависит от длины проходящего через объект света, показателя преломления оптической среды (показатель преломления воздуха равен 1,0; иммерсионного масла – 1,516; стекла –1,520) и апертурного угла объектива. Эту зависимость вывел немецкий физик Эрнст Аббе во второй половине XIX века:

d = l / 2 nsina,

 

где: d – минимальное расстояние между двумя точками, видимыми раздельно;

l – длина волны света, проходящего через исследуемый объект;

nsina – числовая апертура, где n –показатель преломления светом оптической среды, a – апертурный угол объектива.

 

Э. Аббе доказал, что нет смысла беспредельно повышать увеличение светового микроскопа. Минимальное расстояние между двумя точками при освещении объекта светом с длиной волны 550 нм, к которому наиболее чувствителен глаз, при использовании микроскопа, апертурный угол которого 90⁰ (это предельный угол для которого sina=1), для сухой системы составляет около 300 нм, а для иммерсионной системы – около 200 нм.

Таким образом, повысить разрешающую способность микроскопа можно путем:

­ – снижения длины волны света, проходящего через объект;

– использования иммерсионной системы;

– повышения апертурного угла до предельного (до 90⁰).

Микроскопия в темном поле

Используется для исследования слишком малых и слабоконтрастных живых объектов. При микроскопии этим методом используют специальный конденсор темного поля, центр которого затемнен. Поэтому центральный пучок световых лучей не попадает в объектив и поле зрения микроскопа остается темным. Объект освещается только лучами, попадающими на него под углом. Рассеиваясь на объекте, часть лучей изменяет направление и попадает на объектив. Объект становится видимым как светящаяся точка на темном фоне. Метод темного поля позволяет получить представление о внешней форме живых неокрашенных объектов и их движении.

Микроскопия в темном поле позволяет увеличить разрешающую способность объектива примерно в 10 раз и рассматривать объекты, размеры которых находятся за пределами обычного микроскопа. Повышение разрешающей способности достигается за счет увеличения апертурного угла.

 

Фазово-контрастная микроскопия

Дает возможность изучать живые объекты без окраски и фиксирования. Глаз человека реагирует на изменения амплитуды световой волны (интенсивность, контрастность) и ее длины (цвет), но не воспринимает различий по фазе. В биологических препаратах чередуются места, которые в разной степени поглощают свет. Проходя через них, световые волны изменяют свою амплитуду. Такие участки объекта называют амплитудными, и под микроскопом они выглядят более темными. Прозрачные в видимом свете структурные элементы объектов пропускают лучи одинаковой длины и амплитуды, но смещают их фазу. Величина смещения зависит от толщины и показателя преломления структур, но видимых изменений практически не дает. Такие препараты являются неконтрастными.

С помощью фазово-контрастного устройства фазовые изменения световых волн, проходящих через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, благодаря чему детали рассматриваемых объектов становятся видимыми и контрастными.

Фазово-контрастное устройство дает возможность изучать структуры клеток: жгутики и оболочки бактерий, ядра и митохондрии дрожжей и грибов.

Таким образом, хотя разрешающая способность при использовании фазово-контрастной микроскопии не меняется при сравнении со светопольной,качество изображения улучшается за счет повышения контрастности.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия позволяет изучать клетки в живом виде, выявлять мембранные структуры и получать высококонтрастные цветные изображения микроорганизмов.

Сущность явления люминесценции заключается в том, что некоторые молекулы структурных элементов клетки (пигменты, витамины, алкалоиды и др.) способны поглощать часть энергии падающего света определенной длины волны, переходить в электронно-возбужденное состояние и испускать свет с другой длиной волны. Источником возбуждения могут быть ультрафиолетовые лучи (300 – 400 нм) и видимый свет коротковолновой области спектра (400 – 460 нм).

Клетки микроорганизмов обладают слабой собственной (первичной) люминесценцией. Ее можно усилить предварительным окрашиванием препаратов нетоксическими красителями – флуорохромами (акридин оранжевый, нейтральный красный, аурамин, флуоресцин и др.). В результате возникает вторичная люминесценция. Для ее возбуждения достаточно использовать сине-фиолетовую часть спектра. В результате возникает высококонтрастное цветное изображение рассматриваемого объекта.

Таким образом, при использовании люминесцентной микроскопии разрешающая способность микроскопа возрастает по сравнению со светопольной микроскопией за счет уменьшения длины волны проходящего через объект света.

Электронная микроскопия

Максимальная разрешающая способность оптических микроскопов составляет около 0,2 мкм и зависит от длины волны используемых лучей света. Увеличить разрешение в 100 и более раз можно, если вместо световых или ультрафиолетовых лучей применять поток движущихся электронов, обладающих волновыми свойствами (длина волны около 0,04 нм).

Поток электронов движется в безвоздушном пространстве от источника электронов (раскаленная нить вольфрамовой пушки) по направлению к флуоресцентному экрану и вызывает равномерное свечение его. Если же на пути электронов поместить какой-либо объект, то в зависимости от его плотности электроны будут больше или меньше задерживаться, а соответствующие места на экране окажутся более или менее затемненными. Этот простой принцип работы современного электронного микроскопа дополнен принципом отклонения электронных лучей в магнитном поле подобно тому, как световые лучи отклоняются увеличивающими стеклянными линзами. При этом используются электромагнитные линзы.

Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов позволяет наблюдать и изучать объекты, невидимые в оптических микроскопах: вирусы и фаги, микоплазмы, строение клеток прокариотов и эукариотов, их макро- и микроструктурные элементы. Препараты для электронной микроскопии готовят в виде очень тонких срезов на специальных ультрамикротомах или на тончайших пленках – подложках из коллодия. Следовательно, в электронных микроскопах микроорганизмы исследуют не в живом состоянии, а в виде фиксированных препаратов.