Практическая работа 4.3
Изучение активности ферментов: амилазы
Ферменты – это биологические катализаторы. Они облегчают молекулам взаимодействия, ускоряют реакции. Каждая здоровая клетка производит столько молекул, сколько ей нужно – не больше и не меньше, - точно в тот момент, когда эта необходимость возникает. Секрет такой слаженности заключается в присутствии в любой клетке ферментов.
Амилазы относят к гидролитическим ферментам. Источником амилазы человека служит слюна, которая ускоряет гидролиз крахмала. При оптимальной температуре и в нейтральной среде во рту одна молекула амилазы может производить 18000 молекул глюкозы в секунду. Амилазы животного происхождения можно найти в пчелином меде.
Ферменты очень чувствительны к изменениям температуры, кислотности или концентрации посторонних веществ (аспирин, кофеин в кофе, никотин в сигаретах и др.). Температура замерзания почти прекращает ферментативные реакции, низкая температура сильно замедляет их, при повышенной температуре они ускоряются, а при экстремально высоких температурах происходит денатурация белков, что приводит к потере ферментом каталитической активности.
Влияние кислотности среды на активность амилазы
Характерным качеством ферментов является их сильная зависимость от кислотности среды. Как оказалось, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды. Большинство из них предпочитает нейтральную среду (рН около 7), но есть и исключения из этого правила. Оптимальные значения рН для некоторых ферментов: пепсин желудочного сока – 1,5-2,5; амилаза ячменного солода - 5,2; амилаза слюны - 6,8-7,0; уреаза - 7,2-8,0; липаза сыворотки крови - 8,0; фосфатаза плазмы крови (щелочная) - 9,0-10,0.
Цель работы: изучение влияния различных факторов среды на активность амилазы.
Объекты исследования: слюна человека, пчелиный мед.
Реактивы и оборудование:
- раствор иода,
- раствор крахмала,
- раствор слюны,
- раствор пчелиного мёда,
- раствор соляной кислоты (1:10),
- 9%-ный раствор уксусной кислоты,
- 0,5%-ный раствор гидроксида натрия,
- раствор пищевой соды,
- раствор антибиотика,
- три пробирки,
- стаканчики объемом 50 и 250 мл,
- мерный цилиндр объемом 50 мл.
Приготовление растворов
1. Для приготовления раствора слюны соберите в пробирку около 0,5 мл слюны, предварительно ополоснув рот 2-3 раза водой для удаления остатков пищи. Разбавьте водой в 20 раз, доведя объём до 10мл.
2. Для приготовления раствора пчелиного мёда 2-3 капли пчелиного мёда разведите водой в 10 раз и тщательно перемешайте.
Ход работы
1) Пронумеруйте три пробирки: № 1 – контрольная; № 2 и № 3 – опытные.
2) Налейте во все пробирки по 2-3 мл раствора слюны и по 2-3 мл раствора крахмала.
3) Прилейте в пробирку № 1 2-3 мл дистиллированной воды, в пробирку № 2 – 2-3 мл раствора соляной (или уксусной) кислоты, в пробирку №3 – 2-3 мл раствора гидроксида натрия (или соды).
4) Оставьте все пробирки на 20 минут для протекания биохимической реакции.
5) С помощью универсальной индикаторной бумаги определите рН растворов в пробирках № 1-3. Запишите полученные результаты.
6) Через 20 минут добавьте в каждую пробирку по 2 капли раствора йода. Если в пробирку № 3 приливали раствор NаОН, для его нейтрализации прибавьте 2-4 капли раствора соляной кислоты (Это необходимо, чтобы предотвратить взаимодействие йода со щелочью).
7) Охарактеризуйте активность ферментов слюны по изменению интенсивности или исчезновению синей окраски раствора.
8) Аналогично проведите эксперимент с пчелиным медом.
Вопросы и задания для самостоятельной работы:
1. От какого греческого слова произошло название фермента «амилаза»? Какую химическую реакцию ускоряют амилазы и каковы особенности их действия?
2. Характерной особенностью всех α- амилаз является наличие одного атома кальция на молекулу фермента. Роль кальция состоит в том, что он стабилизирует вторичную и третичную структуры молекулы α- амилазы. Почему α- амилазы являются устойчивыми к нагреванию?
3. На чем основан способ разделения α- и β- амилаз солода, где оба фермента присутствуют одновременно?
4. В муке для выпечки ржаного хлеба содержится избыток α- амилазы. Что необходимо добавить в тесто, чтобы предотвратить излишнее декстринирование крахмала и образование клейких веществ в мякише хлеба?
5. Молекулярная масса бактериальной α- амилазы почти вдвое превышает молекулярную массу α- амилазы из плесневого гриба. Как это влияет на их термостабильность?
Практическая работа 4.5
Изучение активности ферментов: оксидазы и пероксидазы
Окислительные ферменты – оксидазы и пероксидазы, – присутствуют во многих живых тканях, потому что окисление лежит в основе процессов дыхания. Но действуют ферменты по-разному: оксидазы окисляют органические вещества кислородом воздуха, пероксидазы для той же цели берут кислород из пероксидов.
При окислении некоторых веществ, например, фенола и гидрохинона, образуются окрашенные продукты реакции. Появление окраски подтверждает работу фермента. А интенсивность окраски позволяет судить о количестве продуктов окисления. В слишком кислой или щелочной среде, или если отсутствуют поставщики кислорода, или в присутствии ингибиторов ферментов окраска не появляется, т.е. фермент становится неактивным.
Цель работы: изучение активности ферментов: оксидазы и пероксидазы в плодах и овощах.
Объекты исследования: капустная кочерыжка, яблоко, клубень картофеля с ростками, луковица с корешками, проросшая в темноте.
Реактивы и оборудование:
- Дистиллированная вода,
- 3%-ный раствор пероксида водорода,
- гидрохинон,
- стаканы,
- сухие пробирки,
- шпатель,
- марля,
- водяная баня.
Ход работы
1) Примерно 20 г капустной кочерыжки измельчить на терке, отжать через два слоя марли или один слой ткани, сок собрать в стакан.
2) Разбавить сок в 10 раз водой (1:10). При исследовании других растительных объектов сок следует разбавить не более чем в 2-3 раза.
3) Пронумеруйте 6 сухих пробирок. Налейте в пробирки № 1-4 по 1 мл раствора сока: в пробирки № 5 и № 6 – по 1 мл дистиллированной воды.
4) Пробирки № 1 и № 2 поставьте для разрушения ферментов на 5 мин в кипящую водяную баню, а затем охладите до комнатной температуры.
5) Во все 6 пробирок добавьте немного, на кончике шпателя, гидрохинона.
6) В пробирки № 1, № 3, № 5 налейте по 5 капель воды, а в пробирки № 2, № 4, № 6 – по 5 капель пероксида водорода Н2О2. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешайте.
7) Через 10-15 мин. наблюдайте за результатами опыта. Запишите их в виде таблицы, указав в ней: номера пробирок, состав смеси, изменение окраски, интенсивность окраски, вывод (произошло ли окисление).
8)Поставьте такие же опыты с клубнем картофеля и его ростками, с мякотью яблок, с мясистыми чешуями луковицы, а также с её донцем и листьями («перьями»).
Вопросы и задания для самостоятельной работы:
1. Может ли пероксид водорода окислять гидрохинон в отсутствие капустного (яблочного, картофельного, луковичного) сока?
2. Окисляется ли гидрохинон под действием капустного (яблочного, картофельного, луковичного) сока без Н2О2?
1. Сохраняется ли активность ферментов в проанализированных соках после кипячения?
2. Какие окислительные ферменты содержатся в проанализированных соках?
3. Потемнение срезов картофеля, яблок, персиков, грибов в большей степени или полностью зависят от действия окислительных ферментов. В пищевой промышленности основной интерес сосредоточен на предотвращении ферментативного потемнения, которое имеет место при сушке этих продуктов. Почему для этого используют предварительную бланшировку или добавление поваренной соли?
4. При ферментации чая происходит окисление дубильных веществ чая с образование темно-окрашенных и ароматических соединений. Оцените роль фермента с потребительской точки зрения.
5. Почему чай теряет свои вкусовые свойства при многократном заваривании одной и той же порции или при его кипячении?
Практическая работа 4.6