Заключение: титр вируса гриппа 1:_______
8. Написать методы индикации вирусов:
в клеточных культурах тканей и в курином эмбрионе:
_________________________________ ___________________________
_________________________________ ___________________________ _________________________________ ___________________________ _________________________________ ___________________________ _________________________________ ___________________________
9. Установить биовар холерного вибриона с помощью определения его чувствительности к диагностическим фагам.
10. Определить фаговары культур золотистого стафилококка, и дать заключение об источниках (источнике) инфекции.
11. Оформить протокол.
12. Результаты определения фаговаров культур золотистого стафилококка:
 | | |
Культура № 1 Культура № 2 Культура № 3
Культура № 1 ___________________________________________________
Культура № 2 ___________________________________________________
Культура № 3 ___________________________________________
13. Заключение по результатам фаготипирования культур _____________________________________________________________
Подпись преподавателя ________________
Занятие №9
Контрольное занятие №1.
Тема: «Морфология, структура и культивирование микроорганизмов».
1. Принципы микроскопии. Основные методы микроскопирования. Методы окраски. Изучение морфологии и отдельных структур микроорганизмов.
2. Систематика микроорганизмов (прокариоты, грибы, простейшие, вирусы). Принципы классификации. Понятие о виде как основной таксономической единице. Таксономические категории. Номенклатура. Основные отличия прокариотов от эукариотов.
3. Строение и химический состав клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Бактерии с дефектом синтеза клеточной стенки: протопласты, сферопласты, L – формы.
4. Капсулы. Жгутики. Пили. Химический состав и функциональное значение этих образований у бактерий. Методы выявления. Патогенные представители.
5. Споры и спорообразование. Химический состав и функциональное значение спор. Методы выявления. Патогенные представители.
6. Метаболизм бактерий. Ферменты бактерий и их роль в обмене веществ. Конститутивные и индуцибельные, экзо- и эндо- ферменты. Практическое использование биохимической активности бактерий.
7. Типы и механизмы питания бактерий. Транспорт питательных веществ в клетку.
8. Дыхание бактерий. Основные типы биологического окисления субстрата. Аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.
9. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения популяции бактерий в стационарных условиях. Периодическое культивирование. Непрерывное культивирование, его значение в биотехнологии.
10. Основные принципы и методы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на рост и размножение. Классификация питательных сред и требования, предъявляемые к ним.
11. Бактериологический метод исследования, его этапы. Выделение чистых культур аэробных бактерий. Изучаемые свойства. Ключевые признаки в идентификации вида.
12. Методы выделения чистых культур анаэробных бактерий. Изучаемые свойства. Ключевые признаки в идентификации вида.
13. Царство вирусов. Классификация. Морфология и строение вирионов. Химический состав, функции структурных элементов. Прионы. Вироиды. Работы Д.И. Ивановского.
14. Механизмы взаимодействия вирусов с соматической клеткой. Продуктивная и интегративная формы. Особенности репродукции РНК- и ДНК – содержащих вирусов.
15. Методы культивирования вирусов в культурах клеток, курином эмбрионе, в организме лабораторных животных. Классификация и характеристика клеточных культур. Среды № 199, Игла, их назначение.
16. Методы индикации вирусной репродукции в клеточных культурах и курином эмбрионе. Сущность реакций вирусной гемадсорбции и гемагглютинации, их применение.
17. Морфология и ультраструктура вирусов бактерий - бактериофагов. Стадии взаимодействия вирулентного и умеренного фага с бактериальной клеткой. Лизогения. Фаговая конверсия. Практическое применение фагов.
18. Патогенные грибы. Морфология, структура, культивирование.
Дата__________________
Занятие №10
Тема: Генетика микроорганизмов. Структура генетического аппарата у бактерий и вирусов. Модификации. Мутации. Генетические рекомбинации. Генетика вирусов. Особенности изменчивости у вирусов.
Вопросы для обсуждения:
1. Организация генетического материала бактерий и вирусов. Генотип и фенотип.
2. Внехромосомные факторы наследственности бактерий: IS-последовательности, транспозоны, плазмиды, вирусы.
3. F – плазмида, её функция. Конъюгативные и неконъюгативные плазмиды.
4. R – плазмида, её значение. Методы выявления чувствительности бактерий к антибиотикам.
5. Плазмиды бактериоциногенности. Определение бактериоциновара и бактериоциногеновара.
6. Плазмиды, кодирующие признаки патогенности.
7. Сущность модификационной изменчивости.
8. Мутации. Молекулярный механизм мутаций. Репарации.
9. Генетические рекомбинации: трансформация, трансдукция, коньюгация.
10. Основы генетической инженерии и биотехнологии.
Практические задания:
1. Выявить изменчивость морфологических свойств бактерий под воздействием:
а) фенола (микроскопировать мазки из колоний Proteus vulgaris, образованных на обычном МПА и на 0,1% феноловом МПА, окрашенных фуксином Пфейффера).
 | |
Рис. 1. Proteus vulgaris в препарате Рис. 2. Proteus vulgaris в препарате
из колонии на МПА из колонии на 0,1% феноловом МПА
б) пенициллина (микроскопировать мазки из колоний Bacillus аnthracis, образованных на МПА с пенициллином, окрашенных метиленовым синим - «жемчужное ожерелье»).
 |  | ||
Рис. 3. B. anthracis в препарате Рис. 4. B. anthracis в препарате из
из колоний на МПА колоний на МПА с пенициллином
(«жемчужное ожерелье»)
2. Изучить изменчивость культуральных свойств: S- и R- формы колоний эшерихий.
3. Определить фенотипические проявления R-плазмиды бактерий (множественная устойчивость к антибиотикам) методом стандартных дисков.
4. Ознакомиться с фенотипическими проявлениями Col-плазмиды с помощью методов колицинотипирования и колициногенотипирования.
 | |
Рис. 5. Метод колицинотипирования Рис. 6. Метод колициногенотипирования
| Вывод: культура E. сoli чувствительна к колицинам__________________ | Вывод: культура E. сoli продуцирует колицины: ______________________ |
5. Ознакомиться с фенотипическими проявлениями Hly-плазмиды (продукция гемолизина) у E. coli на кровяном агаре.
| Рис. 7. Продукция гемолизина Е.coli |
6. Выявить и изучить ауксотрофные мутанты эшерихий, полученные под воздействием ультрафиолетовых лучей:
а) сравнить результаты посева методом реплик облученной УФ-лучами культуры на полноценной (МПА) и минимальной средах;
Рис. 8. Рост культуры на полноценной среде | Рис. 9. Рост культуры на минимальной среде |
б) установить потребности выделенных ауксотрофных мутантов в метаболите на селективной среде, содержащей аминокислоты.
| 
|
|
| 
| ||||
| Лизин | Лейцин | Гистидин | Метионин | Триптофан | ||||
Вывод: ______________________________________________________
7. Учесть результаты опыта конъюгации между E. coli F+, прототроф, Str s и E. coli F-, ауксотроф по метионину, Str r. Определить признак, приобретенный рекомбинантом, образующим колонии на минимальной плотной среде, содержащей стрептомицин 1000 мкг/мл.
Записать результаты опыта конъюгации.
Донор E. coli F+, Str s х Реципиент E. coli F-, Met -, Str r
Селективная среда: минимальная плотная среда, содержащая стрептомицин 1000мкг/мл.
 |
Выявлены колонии рекомбинантов на селективной среде в результате постановки опыта конъюгации.
Донор ____________________________________________________________
Реципиент ________________________________________________________
Рекомбинант ______________________________________________________
Вывод: ___________________________________________________________
Подпись преподавателя ________________
Дата__________________
Занятие №11
Тема: Генетические методы исследования в диагностике инфекционных болезней. Полимеразная цепная реакция. Гибридизация нуклеиновых кислот. Основы генной инженерии и биотехнологии.
Вопросы для обсуждения:
- Какие свойства нуклеиновых кислот положены в основу молекулярно-генетических методов исследования?
- Чем обусловлена геноидентификация видов организмов?
- Сущность метода молекулярной гибридизации (МГ) нуклеиновых кислот.
- «Молекулярный зонд», его назначение.
- Варианты постановки МГ нуклеиновых кислот и результатов ее учета.
- Отличия полимеразной цепной реакции (ПЦР) от метода МГ нуклеиновых кислот.
- Ингредиенты, необходимые для постановки ПЦР.
- Функция «праймеров».
- Этапы цикла ПЦР.
- Методы регистрации ПЦР.
- Рестрикционный анализ (сиквенс-анализ), его применение.
- Риботипирование, его практическое использование.
- Основы генной инженерии и биотехнологии.
Практические задания:
1. Изучить схемы постановки:
а) метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот;
б) полимеразной цепной реакции.
2. Учесть результаты ПЦР на агарозном геле после разделения продуктов амплификации ДНК микроорганизмов методом электрофореза и окрашивания этидием бромида. Выявить геномные фрагменты и сопоставить их с контрольным образцом.
3. Дорисовать схему постановки метода молекулярной гибридизации.
| Двуцепочечная ДНК-мишень, | |
| Денатурация ДНК | |
| Присоединение ДНК-зонда (возможные метки: изотоп, ФИТЦ, фермент) | |
| Разделение одно- и двуцепочечных фрагментов ДНК | |
| Детекция двуцепочечных ДНК |
Рис. 1. Схема постановки метода молекулярной гибридизации.
4. Дорисовать схему постановки метода молекулярной ПЦР.
Ингредиенты для постановки ПЦР: праймеры, азотистые основания, термостабильная ДНК-полимераза.
| Двуцепочная ДНК-мишень | |
| Праймеры, комплементарные консервативным последовательностям нуклеиновых кислот | |
| 1-й цикл | |
| 1-й этап. Денатурация ДНК при 90-950С | |
| 2-й этап. Отжиг праймеров при 50-650С | |
| 3-й этап. Достраивание комплементарнй цепи ДНК при участии ДНК-полимеразы при 720С |
Повторные циклы приводят к накоплению последовательности ДНК, ограниченной праймерами.
Детекция двуцепочечных ДНК.
Рис. 2. Схема постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Подпись преподавателя ________________
Дата__________________
Занятие №12
Тема: Антимикробные препараты. Антибиотики. Врожденная и приобретенная резистентность бактерий к антибиотикам.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Антимикотики. Антивирусные препараты.
Вопросы для обсуждения:
1. Определение понятия «антибиотики».
2. Избирательная активность антибактериальных препаратов.
3. Классификация антибиотиков (происхождение, химический состав, спектр действия, механизм действия).
4. Основные группы антибиотиков и механизмы их противомикробного действия.
5. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.
6. Генетические основы резистентности микроорганизмов к антибиотикам.
7. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (метод дисков, метод серийных разведений, геноиндикация – ПЦР).
8. Применение автоматизированных анализаторов для определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
9. Измерение эффективности действия антибиотиков: минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация (МИК, МПК). Минимальная бактерицидная концентрация (МБК).
10. Пути преодоления устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.
11. Лечебные химиотерапевтические противогрибковые препараты.
12. Противовирусные химиотерапевтические препараты (общие понятия).
13. Классификация противовирусных химиопрепаратов в зависимости от механизма действия, мишени для действия препаратов:
§ ингибиторы депротеинизации (ремантадин);
§ ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (рибавирин);
§ ингибиторы обратной транскриптазы ретровирусов (азидотимидин, зидовудин);
§ ингибиторы вирусных протеаз (саквинавир).
Практические задания:
1. Определить чувствительность S. aureus к антибиотикам методом стандартных дисков и оценить полученные результаты.
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
Таблица 1.
Результаты определения чувствительности S. aureus к антибиотикам методом стандартных дисков
| Антибиотик | Зона задержки роста в диаметре (мм) | Оценка чувствительности |
Критерии* оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
Зона задержки роста в диаметре.
> 25 мм - высокая чувствительность к антибиотику
15-20 мм – умеренная чувствительность – “ -
10-15 мм – низкая чувствительность – “ -
< 10 мм – нечувствительность или устойчивость к антибиотику.
* - смотри приложение в конце протокола
2. Выявить чувствительность S. aureus к стрептомицину методом серийных разведений в МПБ. Определить минимальную ингибирующую концентрацию и минимальную бактерицидную концентрацию стрептомицина.
1) Наличие роста S. аureus (помутнение среды) выявлено в пробирках с МПБ, содержащих следующие концентрации антибиотика ____________________
2) Отсутствие роста S. аureus (прозрачный МПБ) отмечается в пробирках с МПБ, содержащих следующие концентрации антибиотика ________________
Вывод: минимальная, ингибирующая рост St. aureus концентрация стрептомицина составляет ______________мкг/мл.
3) При высеве на МПА из пробирок с отсутствием роста S. аureus получены следующие результаты: _________________________________
_______________________________________________________________
 |
Вывод: минимальная бактерицидная концентрация стрептомицина в отношении S. аureus составляет ______________мкг/мл.
3. Указать основные мишени бактериальной клетки и действующие на них антибиотики.
Клеточная
| 1 стенка 2 | ||||
| ЦПМ 3,4 | |||
| № | Наименование мишени | Механизм действия антибиотика | ||
4. Изучить противогрибковые препараты (полиеновые антибиотики, имидазолы и др.) и указать механизм их действия.
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Подпись преподавателя ________________
Приложение 1:
*Критерии оценки чувствительности стафилококков к антибактериальным препаратам
| Антибактериальные препараты, группа | Диаметры зон ингибиции (мм) | ||
| R | I | S | |
| Беталактамы бензилпенициллин | < 28 | - | > 29 |
| Макролиды эритромицин | < 13 | 14-22 | > 23 |
| Аминогликозиды амикацин | < 14 | 15-16 | > 17 |
| канамицин | < 13 | 14-17 | > 18 |
| Линкозамиды линкомицин | < 17 | 18-20 | > 21 |
| Гликопептиды ванкомицин | - | - | > 15 |
| Тетрациклины тетрацинклин | < 14 | 15-18 | > 19 |
| Хинолоны ципрофлоксацин | < 15 | 16-20 | > 21 |
| Другие препараты рифампин | < 16 | 17-19 | > 20 |
Примечание: R- резистентные штаммы, I - умеренно чувствительные, S – чувствительные
Приложения 2.
Группы микроорганизмов по степени чувствительности к антибиотикам
(МИК в мкг/мл или ЕД/мл)
| Антибиотик | Группы микроорганизмов | |||
| чувствительные | средне чувствительные | умеренно чувствительные | устойчивые | |
| ампициллин | 0,25 | ³128 | ||
| цефалоспорины | ³128 | |||
| стрептомицин | - | ³128 | ||
| тетрациклины | ³64 | |||
| эритромицин | ³64 | |||
| левомицетин | - | ³64 |
Дата__________________
Занятие №13
Тема: Экология микроорганизмов. Санитарная микробиология. Нормальная микрофлора организма человека и её становление. Препараты для коррекции микрофлоры.
Вопросы для обсуждения:
1. Санитарная микробиология, ее задачи. Санитарно-показательные микроорганизмы. Критерии достоверности выбора санитарно-показательных микроорганизмов.
2. Микрофлора воды. Эпидемиологическое значение воды как фактора распространения некоторых патогенных микроорганизмов.
3. Микробиологическое исследование воды: микробное число, ОКБ и ТКБ. Санитарные нормы для воды централизованного водоснабжения.
4. Микрофлора воздуха. Патогенные микроорганизмы, передающиеся через воздух.
5. Микробиологическое исследование воздуха. Показатели оценки санитарно-гигиенического состояния воздуха в лечебных учреждениях.
6. Понятие о микробиоценозе. Микробная флора органов и тканей как гомеостатическое звено. Становление нормальной микрофлоры человека.
7. Микрофлора кожи, ее значение.
8. Микрофлора верхних дыхательных путей, ее значение.
9. Микрофлора ротовой полости и ее значение.
10. Микрофлора желудочно-кишечного тракта (пищевод, желудок, тонкая кишка, толстая кишка), ее значение.
11. Микрорфлора мочевыводящих путей, ее значение.
12. Микрофлора половых путей, ее значение.
13. Физиологические функции естественной микрофлоры организма человека, участие ее в колонизационной резистентности.
14. Состояние эубиоза и дисбиоза (дисбактериоза).
15. Микробиологическая диагностика кишечного дисбактериоза.
16. Принципы лечения дисбактериоза. Применение препаратов для нормализации микрофлоры и повышения иммунологической реактивности организма (пробиотики, пребиотики, синбиотики).
17. Основные правила взятия материала от больных для микробиологического исследования.
Практические задания:
1. Определить общее микробное число (ОМЧ) питьевой воды централизованного водоснабжения (КОЕ/мл).
1.1. Учесть результаты посева пробы исследуемой воды: подсчитать количество образованных колоний на поверхности и в глубине питательного агара на двух чашках (рассчитать среднее арифметическое).
Количество колоний: чашка № 1 __________ чашка № 2 __________
Общее микробное число _________________ (КОЕ/мл)
1.2.Дать заключение о соответствии полученного результата требованиям, предъявляемым к микробиологической чистоте питьевой воды: ______________________
(соответствует или не соответствует санитарным нормам)
2. Определить количество ОКБ и ТКБ питьевой воды централизованного водоснабжения методом мембранных фильтров.
2.1. Учесть результаты посева на среду Эндо проб исследуемой воды после ее фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры. Подсчитать количество образованных лактозоположительных колоний на фильтре после культивирования в термостате в течение суток при t=37ºС (для ОКБ) и 44 ºС (для ТКБ) и записать полученные результаты.
2.2. Дать заключение о соответствии полученных результатов требованиям, предъявляемым к микробиологической чистоте питьевой воды:
Проба № 1 - _________, Проба № 2 - _______________Проба № 3 - ________________ (соответствует или не соответствует санитарным нормам)
3. Определить количество ОКБ и ТКБ питьевой воды централизованного водоснабжения титрационным (бродильным) методом
3.1. Учесть результаты посева проб исследуемой воды в лактозо-пептонную среду.
3.2. Дать заключение о соответствии полученного результата требованиям, предъявляемым к микробиологической чистоте питьевой воды: ______________________
(соответствует или не соответствует санитарным нормам)
4. Изучить нормативные показатели микробиологической чистоты питьевой воды (табл.1). Записать показатели качества воды централизованного водоснабжения: ОМЧ-__________,
ОКБ_______________________, ТКБ ___________________.
5. Определить общее микробное число (КОЕ/м3) воздуха учебной комнаты методом естественной седиментации.
5.1.Подсчитать количество образованных колоний на поверхности питательного агара.
5.2.Определить по формуле В.Л. Омелянского количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 м 3 воздуха.
По формуле В.Л. Омелянского: на 100 см2 поверхности питательного агара в течение 5 минут оседают микроорганизмы, находящиеся в 10 л воздуха (10 дм3).
Площадь чашки Петри – 78,5 см2.
Время седиментации микроорганизмов из воздуха – 5 мин.
Количество колоний, которые образовались бы на поверхности питательной среды площадью в 100 см2 при данной экспозиции – а:
| а = | количество колоний на поверхности питательного агарах100 | |
| 78,5 см2 |
а - количество микроорганизмов в 10 л воздуха, а в 1м 3 – Х.
| Х = | ах1000 | или Х = а х 100 |
Заключение:
Общее микробное число воздуха учебной комнаты составляет _____ КОЕ/м3.
6. Изучить нормативные показатели санитарно-гигиенического состояния воздуха в помещениях лечебных учреждений (по таблице). Записать показатели чистоты воздуха операционных помещений: ОМЧ в 1 м3 операционной до начала работы__________, во время работы; число колоний S. аureus в 1 м3____________, число колоний плесневых и дрожжевых грибов в 1дм 3 воздуха _____________________.
7. Изучить характер роста бактерий, полученных при посеве отделяемого слизистой зева, на кровяном агаре. Описать культуральные свойства отмеченных изолированных колоний по указанной форме:
Таблица
Характеристика колоний
| Свойства колоний | Колонии | |
| №1 | №2 | |
| Размер | ||
| Форма | ||
| Края | ||
| Прозрачность | ||
| Расположение по отношению к поверхности питательной среды | ||
| Поверхность | ||
| Пигмент | ||
| Структура |
8. Приготовить мазки из отмеченных колоний, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать. Под рисунками указать мофологические и тинкториальные свойства микроорганизмов.
 |
Рис. 1. _____________________ Рис. 2. __________________________
___________________________ _______________________________
9. Указать основные группы микроорганизмов, специфичные для различных биотопов организма человека.
Кожные покровы: _____________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Ротовая полость: ______________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________Пищевод и желудок:___________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Тонкая кишка: ________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Толстая кишка: ________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Вульва и вагина: ____________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
10. Перечислить функции нормальной микрофлоры человека: ______________________
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
11. Записать наиболее распространенные биологические препараты, применяемые для восстановления микрофлоры кишечника и указать из каких микроорганизмов они приготовлены._____________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Подпись преподавателя ________________
Дата__________________
Занятие №14
Тема: Инфекция и инфекционный процесс.
Вопросы для обсуждения:
1. Инфекционный процесс, его основные факторы.
2. Патогенность и вирулентность микроорганизмов.
3. Методы определения и единицы измерения вирулентности.
4. Факторы патогенности, обеспечивающие адгезию, колонизацию, инвазию и агрессивность микроорганизмов.
5. Характеристика токсинов бактерий.
6. Протеиновые бактериальные токсины и их биологические свойства.
7. Эндотоксины и их биологические свойства.
8. Генетическая регуляция факторов патогенности, «острова и островки» патогенности у бактерий и их роль в формировании новых высоковирулентных эпидемических штаммов.
9. Значение состояния макроорганизма в возникновении и развитии инфекционного процесса.
10. Влияние факторов окружающей среды и социальных факторов на возникновение и развитие инфекционного процесса.
11. Инфекционная болезнь. Характеристика особенностей инфекционной болезни.
12. Динамика развития инфекционного процесса. Периоды течения инфекционной болезни.
13. Формы проявления инфекции.
14. Понятие об эпидемическом процессе и его элементах (источник, механизм, пути и факторы передачи возбудителя болезни. Восприимчивость коллектива).
15. Эколого-эпидемиологическая характеристика инфекционных болезней: антропонозы, зоонозы, сапронозы.
16. Понятие о карантинных (конвенционных) и особо опасных инфекциях.
Практические задания:
I. Изучить факторы патогенности бактерий:
1. Демонстрация продукции Staphylococcus aureus:
1.1. гемолизина на кровяном агаре;
1.2. лецитиназы на желточно-солевом агаре;
1.3. плазмокоагулазы в цитратной плазме крови.
2. Зарисовать проявление гемолитической и лецитиназной активности S. аureus на питательных средах.
 |  |
Рис. 1. Проявление гемолитической Рис. 2. Проявление лецитиназной активности S. аureus на кровяном агаре активности на желточно- солевом агаре
3. Зарисовать капсулы Klebsiella pneumoniae, выявленные при микроскопии препарата, приготовленного из чистой культуры клебсиелл и окрашенного по Бурри-Гинсу.
| Рис. 3.Капсулы Klebsiella pneumoniae. Окраска по Бурри-Гинсу |
4. Учесть и зарисовать результаты определения токсигенности Corynebacteium diphtheriae методом иммунодиффузии в специальной агаровой питательной среде.
| Рис. 4.Результаты определения токсигенности Corynebacteium diphtheriae (метод иммунодиффузии) |
II. Внести в таблицу сведения о свойствах бактериальных токсинов.
Таблица