На каждом энергетическом уровне могут находиться два электрона с противоположными спинами. При поглощении кванта эми (УФ и большей длины волны) происходит переход одного из электронов с заполненного уровня (S0) на более высокоэнергетическую орбиталь S1, S2.
А) флюоресценция;
Уровни S1…Sn называются синглетными, если при переходе электрона с более низкого уровня на них его спин не изменяется. Время жизни молекул в состоянии S1 составляет 10-8-10-9с. С определённой вероятностью могут реализоваться следующие процессы, сопровождающие переход в S0:
-выделение тепла S1-w S0;
-испускание кванта флюоресценции – избыточная энергия полностью или частично выделяется в виде кванта света – S1→S0+ hν;
-фотохимическая реакция – молекула в состоянии S1 имеет энергию ВЗМО выше, чем энергия НСМО у вещества – акцептора. Поэтому окислительно-восстановительная реакция может произойти. S1→продукт;
-перенос энергии на другую молекулу.
-обращение спина электрона и переход молекулы в триплетное состояние Т1.
Б) фосфоресценция;
Переход из Т1 в S0 запрещён, поскольку не может быть на одной орбитали двух электронов с противоположными спинами. Для того, чтобы такой переход состоялся, необходимо ещё одно обращение спина. Поэтому в состоянии Т1 молекула может находиться значительно дольше, чем в состоянии S1 – от 10-4 до 10 с. Переходы в состояние S0 (с оборотом спина) могут сопровождаться теми же явлениями, что и S1→S0. Испускание кванта в процессе с оборотом спина называется фосфоресценцией.
Люминесценция – обобщённое название флюоресценции и фосфоресценции.
В) хемилюминесценция
Или сверхслабое свечение, сопровождающее химические реакции. Его впервые зарегистрировал Гурвич в 1934 году как УФ излучение, испускаемое животными и растительными клетками. В дальнейшем было показано, что источником этого свечения является рекомбинация перекисных свободных радикалов липидов (RO2●+ RO2●→продукты*→продукты + hν)
Люминесценция в природе, ее использование в биологии и медицине:
Регистрация люминесценции в биологии и медицине используется для качественного и количественного анализа, а также для изучения структуры и функции биосистем. Измерение производят на спектрофлюориметрах. Главными параметрами являются спектр люминесценции, её квантовый выход, спектр возбуждения люминесценции, поляризация люминесценции, время жизни молекулы в возбуждённом состоянии.
Интенсивность люминесценции (Iл), как и интенсивность всякого света (плотностью потока световой энергии) называют отношение энергии, переносимой светом через площадь, перпендикулярную световому лучу, к продолжительности времени переноса и к размеру площади. Измеряется либо в Вт/кв.м, либо в эйнштейнах/кв.м с, где эйнштейн (Э) – число фотонов, равное числу Авогадро. Она будет возрастать с увеличением интенсивности падающего света, способности вещества поглощать падающий свет, квантового выхода люминесценции (φ).
φ =число излученных квантов/число поглощенных квантов
А) для определения конкретных веществ;
Если квантовый выход люминесценции больше 1%, то такие соединения легко обнаруживаются люминесцентным методом. Высоким квантовым выходом обладает триптофан (мах 350нм), флавины, НАД●Н и НАДф●Н, витамины А, В6, Е, некоторые лекарственные вещества – хинин, некоторые канцерогены: бензпирен, дибензантрацен. При возбуждении ближним ультрафиолетом (365нм) обнаруживаются грибковые инфекции волос по желто-зеленой флюоресценции. Дерматомикозы у животных. Некоторые соединения, исходно не обладающие флюоресценцией, после химической обработки дают соединения, обладающие высоким квантовым выходом. Таковы героин, морфин, витамины С, В, В12. Чувствительность таких методов – до 10-8 грамма (или примерно до 10-10 М).
Степень поляризации флюоресценции (доля поляризованного света в общей суммарной интенсивности флюоресценции) – важный показатель для исследования вязкости среды, содержащей флюоресцирующую молекулу. Если возбуждающий свет поляризован, то и флюоресценция будет поляризована. Но если за время жизни молекулы в возбужденном состоянии (τ) молекула успеет повернуться, то степень поляризации будет ниже, чем в случае, когда она оставалась неподвижной.
Б) для определения активности нейтрофилов и макрофагов;
Различными исследователями обнаружено, что активированные нейтрофилы и макрофаги продуцируют супероксидный радикал О2-(обнаружено по восстановлению цитохрома С, а также по индуцированной люминолом хемилюминесценции). У неактивированных клеток продукция активных форм кислорода не зафиксирована.
Супероксид претерпевает следующие превращения с образованием мощных окислителей:
2Н++О2-+ О2-→Н2О2+О2
Н2О2+Fe2+ → OH●+OH-+Fe3+
NO+ О2-→NOO-
Н2О2+Cl-→ Н2О+ClO-
Обнаружение супероксидов проводится при помощи люминол-зависимой хемилюминесценции.
В) в микроскопии;
Люминесцентная микроскопия — оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нему.
Флюорохромы, как правило, флюоресцируют по-разному в зависимости от химического состава структур, с которыми они взаимодействуют. Некоторые из них обладают сродством к определенным клеточным структурам. Например, акридиновый оранжевый краситель окрашивает нуклеопротеиды клетки, аурамин — воскоподобное вещество, содержащееся в микобактериях. Некоторые микрообъекты не требуют предварительной окраски флюорохромами и изучаются с помощью люминесцентной микроскопии без окраски. См. также Люминесцентный анализ, Люминесценция.
Люминесцентная микроскопия (флюоресцентная микроскопия) — специальный вид микроскопирования, основанный на использовании собственной (первичной) или наведенной (вторичной) фотолюминесценции микроскопических объектов. Видимая люминесценция (см.) препарата возбуждается либо сине-фиолетовым светом, либо ультрафиолетовыми лучами.
Люминесцентный микроскоп в принципе — обычный биологический микроскоп, снабженный двумя светофильтрами: один пропускает только возбуждающие сине- или ультрафиолетовые лучи (его помещают перед источником света), другой поглощает эти лучи и пропускает только более длинноволновый свет люминесценции препарата (его устанавливают в тубусе или на окуляре микроскопа). Источниками света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления (типа ДРП1) или лампы накаливания точечного типа. Яркое цветное свечение объектов на темном фоне обеспечивает высокий контраст. Оптико-механическая промышленность выпускает специальные люминесцентные микроскопы и отдельные осветители.
Лишь немногие биологически значимые вещества имеют выраженную собственную люминесценцию в видимой области спектра. К ним относятся некоторые пигменты (хлорофилл, порфирины, липохромы), витамины А и В2, алкалоиды (берберин, хинин и др.), антибиотики (тетрациклины и др.), химиотерапевтические и токсические вещества. Проникновение этих веществ в органы и клетки, их распределение и превращения могут быть прослежены при помощи прижизненной люминесцентной микроскопии. Чаще в люминесцентной микроскопии используют люминесцентную «окраску» специальными веществами (флюорохромами), избирательно придающими тонким структурам клетки и тканей способность люминесцировать (люминесцентная цитохимия). Так, например, флюорохром акридиновый оранжевый применяют для контрастирования ядерных структур, выявления нуклеиновых кислот, мукополисахаридов, для обнаружения микробов и крупных вирусов, для цитодиагностики, в том числе распознавания в мазках раковых клеток; аурамин 00 служит для выявления кислотоустойчивых бактерий (туберкулеза, проказы), риккетсий и некоторых вирусов; примулин — для флюорохромирования элементарных телец вирусов и различения живых и мертвых клеток; фосфин ЗК, нильский голубой и бензпирен — для локализации липидов в клетках.
Особое значение в люминесцентной микроскопии придается люминесцентно-иммунологическим методам [Куне (A. Coons) с сотр., 1942, 1950], основанным на применении люминесцентно меченных специфических сывороток (антител). Метчиком чаще служит флюорохром изотиоцианат флюоресцеина. Получаемый комплекс «антитело-флюорохром» позволяет быстро обнаруживать, идентифицировать и локализовать даже ничтожные количества соответствующих антигенов, в том числе вирусов, риккетсий, бактерий на фоне посторонней микрофлоры, а также выявлять специфические белки, ферменты, полисахариды в клетках и тканях. Наряду с визуальными наблюдениями и фотографированием в Л.м. все шире применяется объективная регистрация интенсивности, спектров и выхода люминесценции.
При помощи ультрафиолетовой Л.м. исследуется собственная ультрафиолетовая невидимая в обычных условиях люминесценция объектов (Е. М. Брумберг), тонко отражающая особенности их физиологического состояния.
Люминесцентная микроскопия клеток и тканей. При люминесцентной микроскопии можно изучать первичную (ткани и органы человека и животных имеют нерезкую белёсую, голубую или синюю люминесценцию) и вторичную люминесценцию клеток и тканей. Изучение вторичной люминесценции живых и фиксированных клеток и тканей (после их «окраски» флюорохромами) получило широкое распространение. При изучении живых клеток флюоресцирующие вещества применяют в очень малых количествах, не вызывающих токсического действия. В цитологических исследованиях Л. м. применяют при диагностике злокачественных новообразований в соскобах, пунктатах, мокроте, промывных водах. Этот метод позволяет быстро получить ярко окрашенный препарат, в котором атипичные клетки выделяются ярким свечением, оттенками цвета и структурой. Л. м. применяется и в гистохимии. Использование акридинового оранжевого позволяет выявить нуклеиновые кислоты, при этом ДНК дает зеленую, а РНК — красную флюоресценцию. Тот же флюорохром в нефиксированных срезах помогает выявить мукополисахариды, а при модификации этого метода — муцины. Фосфин 3R, родамин В, бензпирен и др. выявляют в срезах липиды.