ДОПУСТИТЬКЗАЩИТЕ
Заведующийкафедройэкологии,
докторбиологическихнаук,профессор
_____________А.А.Москалёв
«_____»____________2017г.
КУРСОВАЯРАБОТА
Оценкавлиянияэкстрактовлишайников Everniamesomorpha и Usnealapponica напродолжительностьжизни Drosophilamelanogaster
Направлениеподготовки05.03.06-Экологияиприродопользование
Профиль«Экологическая безопасность»
| Исполнитель: обучающийся234группы Научныйруководитель: к.б.н.,доцент | __________________Д.А.Голубев (подпись) __________________С.Н.Плюснин (подпись) |
Сыктывкар,2017
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ.. 3
Глава 1. Особенности модельных видов лишайников. 4
1.1 Особенности Evernia mesomorpha. 4
1.2 Особенности Usnea lapponica. 5
1.3 Таксономический анализ лихенофлоры.. 6
1.4 Экологический анализ. 9
Глава 2 Drosophila melanogaster как модельный объект в исследованиях биологической активности веществ 11
2.2. Питательная среда для поддержания жизни Drosophila. 14
2.3 Продолжительность и стрессоустойчивость Drosophila melanogaster 16
2.3 Влияние доз ионизирующего облучения на Drosophila melonagaster 18
2.4 Факторы влияющие на продолжительность жизни. 21
2.5 Стрессоустойчивость Drosophilamelanogaster 23
2.6 Влияние голодания на Drosophilamelanogaster 24
2.7 Влияние температуры на Drosophilamelanogaster 26
Глава 3. Материалы и методы.. 29
4. Результаты.. 30
Выводы.. 44
Использованная литература. 45
ВВЕДЕНИЕ
Продолжительностьжизниявляетсяоднимизнаиболеебиологическиисоциальнозначимыхколичественныхпризнаковорганизма.Внастоящеевремяпроводитсябольшоечислоисследованийпопоискуспособовповышениястрессовойустойчивостиорганизмаипутейпродленияздоровойжизни.Втомчислеведётсяпоискбиологическиактивныхвеществрастительногопроисхождения,способныхвлиятьнапродолжительностьжизни.Кперспективнымисточникамтакихсоединенийотносятсяилишайники.
Цельработы –оценитьвлияниеэкстрактовлишайников Usnea и Evernia напродолжительностьжизниособей Drosophilamelanogaster
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1.Выявитьсоставвторичныхметаболитовлишайников Everniamesomorpha и Usnealapponica.
2.Выявитьвлияниевеществнадрозофил.
3.Оценитьбиологическуюактивностьисследуемыхлишайниковыхвеществ.
Глава 1. Особенности модельных видов лишайников
1.1Особенности Everniamesomorpha
Everniamesomorpha- видлишайниковродаЭверния(Evernia)семействаПармелиевые(Parmeliaceae).Слоевищекустистое,прямостоячее,чащеповисающее,2,5—10,0смдлины.Лопасти1,0—2,5ммширины,дихотомическиразветвлённые,болееилименееуплощённые,иногдаслегкаокруглые,радиальногостроения,одинаковоокрашенныхсобеихсторон.Соредииточковидные,беловатыеилисероватые,частомногочисленные,покрываютвсюповерхностьлопастей.Изидиииногдаразвиваютсяоченьобильно,короткие,изредкадо2ммдлины,палочковидные,простыеилиразветвлённые,сероватые.Апотецииразвиваютсядовольноредко,до3мм,расположеныпокраямслоевищныхлопастей,блюдцевиднойформы,стёмно-коричневымдиском,окружённымтонкимкраем,одногоцветасослоевищем.Аски8-споровые,округлые.Спорыяйцевидные,бесцветные,7—10×5—6мкм,одноклеточные.
Накоредеревьевлиственныхихвойныхпород,режеобработаннойдревесинеикамнях.Особеннообильноразвиваетсянастволахдеревьеввосвещённыхместах.Присутствуютвторичныеметаболиты:диварикатоваяиусниноваякислоты,иногдаатранорин
1.2 ОсобенностиUsnealapponica
Особенностибиологиииэкологии: Слоевищекустистое,довольнонежное,болееилименееторчащееилислегкаповисающее,нередкодугообразноизогнутое,обычносхорошозаметнойглавнойветвьюиодносторонненаправленнымибоковымиответвлениями,светло-зеленовато-сероватоеилисоломенно-зеленовато-сероватое,уоснованиязачерненноеислабозауженное.Веточкисредкорасположеннымипоперечнымитрещинками,густорасположеннымисосочками,фибрилламиимногочисленными,крупными,скученными,нередкосливающимисясоралями.Апотециинеизвестны.Размножениевегетативное(соредиями).Эпифит.Мезофит.Растетнахвойныхпородах,реженаберёзахвхвойныхлесах(2).ВМосковскойобластиобычновстречаетсявсмешанныхлесахнаберёзах.
Присутствуютвторичныеметаболиты:барбатиновая,беомицетовая,скваматовая,тамноловая,усиноваякислоты
1.3 Таксономическийанализлихенофлоры
Врезультатеобобщенияданных,полученныхкакврезультатесобственныхисследований,такиизлитературныхисточников,составленсписоклишайниковРеспубликиКоми,которыйнасчитывает982вида(988таксоноввключаяподвидыиваритеты)лишайниковиассоциированныхснимигрибовиз70семействи216родов.Неимеютсемейств19видовлишайников.СистематическаяструктурабиотылишайниковреспубликитипичнадляумереннойзоныСеверногополушария.ВедущееположениезанимаютсемействаLecanoraceae(95видов),Parmeliaceae(83),Cladoniaceae(65),Physciaceae(59),Pertusariaceae(43),Teloschistaceae(38),Bacidiaceae(36),Verrucariaceae(33),LecideaceaeиPeltigeraceae(по28видовкаждое).Первыедесятьсемействобъединяютболееполовины(52%)видовогосоставалишайников,чтотакжеявляетсяхарактернойчертойлихенобиотбореальныхрайонов.ВдесяткулидирующихпочислувидовродоввходятCladonia(63вида),Lecanora(54),Caloplaca(31),Pertusaria(30),Peltigera(24),LecideaиRhizocarpon(по22видакаждый),Micarea(20),Stereocaulon(18),ArthoniaиChaenotheca(по18видовкаждый).Наборведущихпочислувидовсемействиродовуказываетнаеегорно-бореальныечерты.ВысокоеположениевсемейственномспектреLecanoraceae,Cladoniaceae,Parmeliaceae,Peltigeraceae,PhysciaceaeиBacidiaceaeхарактернокакдлягорных,такравнинныхрайоновбореальнойзоны,представителисем.Teloschistaceae,Lecideaceae–типичныегорныевиды,асем.PertusariaceaeиVerrucariaceaeзанимаютлидирующееположениеварктическихиарктовысокогорныхрайонах.Горныечертыпроявляютсяинародовомуровнезасчетвысокихпозицийр.Caloplaca,Pertusaria,Lecidea,RhizocarponиStereocaulon.НаиболееизученнойвлихенологическомотношенииявляетсятерриторияПечоро-Илычскогозаповедника(площадь721,3тыс.га),гдезарегистрировано796видовлишайниковиассоциированныхснимигрибов.Этосоставляетболее80%всеговидовогосоставалишайниковреспублики,чтоуказываетнавысокуюрепрезентативностьтерритории.Болеетретивсехлишайников(384вида)найденытольковрезервате.ВнастоящеевремявПечоро-ИлычскомзаповедникевыявленосамоевысокоеразнообразиелихенизированныхгрибовсредивсехзаповедниковРоссии.Натерриториизаповедникаиегобуфернойзонывыявлено65из79видовлишайников,охраняемыхнареспубликанскомуровне.ПятьвидовподлежатохраненатерриторииРоссии:Bryoriafremontii,Leptogiumburnetiae,Lichenomphalinahudsoniana,Lobariapulmonaria,Tucknerarialaureri.Национальныйпарк«Югыдва»(площадь1891,7тыс.га)влихенологическомотношенииизученслабее.ПоданнымТ.Н.Пыстиной,Я.Херманссона(2004,неопубл.)иС.Н.Плюснина(2006,неопубл.),наПриполярномУралевстречаетсяболее450видов.ВтаксономическойструктурелихенобиотынаибольшимвидовымразнообразиемхарактеризуютсясемействаParmeliaceae(68видов)Cladoniaceae(51),Lecanoraceae(36),Physciaceae(26),Pertusariaceae(21),Bacidiaceae(20),Lecideaceae(19)идр.ВспектреведущихродовлидируютCladonia(49видов),Lecanora(21),LecideaиPeltigera(по16видовкаждый),Caloplaca,PertusariaиStereocaulon(по13видов).Списокохраняемыхвреспубликелишайниковзначительноменьше–всего19видов.В2000г.специалистамиИнститутабиологииначатаинвентаризацияобъектовсистемыООПТсцельюполучениядополнительнойинформацииобихбиологическомразнообразии.Втечение2000–2007гг.лихенологическиеработыбылипроведенынатерритории14комплексныхилесныхзаказниковреспубликанскогозначения.ВходеинвентаризациибылаподтвержденавысокаяценностьландшафтовбольшинстваобследованныхООПТспозициивысокоговидовогоразнообразиялишайниковиместобитанияредкихиохраняемыхвидов.Общеечисловидовлишайников,обнаруженныхвпределахизученныхООПТ,–более420.Несмотряназначительныйобъемпроделаннойработы,списоквидовлишайниковРеспубликиКомидалекдозавершения.Малочисленнысовременныеданныеоразнообразиилишайниковсеверныхтерриторий:лесотундровойитундровойзон,подзонсевернойикрайнесевернойтайги.ОбширныепространствазападныхмакросклоновУральскойгорнойстраны,особенноПриполярногоиПолярногоУрала,влихенологическомпланеобследованыкрайнеслабо.Разрозненнысведенияосоставелишайниковыхгруппировокподгольцовыхредколесий,горныхтундр,каменистыхроссыпейиосыпей(курумов),останцов.Необходимопродолжитьисследованиянаособоохраняемыхтерриториях.Преждевсегоэтокасаетсякрупнейшегообъектаприродно-заповедногофондаРеспубликиКоми–национальногопарка«ЮгыдВа»,длякоторогосведенияовидовомразнообразиилишайниковфрагментарны.Особуюперспективуспозициинаходокновыхиредкихвидовпредставляютзаказники,натерриториикоторыхрасположеныскалистыевыходыкарбонатныхгорныхпородссохранившимисясовременпоследнегооледененияреликтовымикомплексамивидов.(Охраняемые..,2007).
1.4 Экологическийанализ
Экологическиегруппылишайниковпоотношениюксубстрату(эколого-субстратныегруппы).Многообразиелишайниковвзначительнойстепениопределяетсяразнообразиемсубстратов,пригодныхдляихобитания(Макаре-вич,1958;Hale,1967;Ahti,1977;Макрый,1990идр.).Выделеныследующиеэколого-субстратныегруппы:эпифиты,эпиксилы,эпигеиды,эпилиты,эпибриофитыипаразиты.Длялихенофлорыизученнойтерритории,какидлямногихдругихумеренныхобластейГоларктики,характернопреобладаниеэпифитныхлишайников-253вида,изнихвлесахвстречается251вид.Высокочислоэпиксилов91вид.Эпигейныелишайникииэпибриофитныелишайникиобъединяют66и9видовсоответственно.Всамостоятельнуюгруппупаразитывыделенывиды(7),поселяющиесянаталломахдругихлишайниковиживущиезаихсчет.Эпили-товвсеголишьтривида.Составэпифитовбылизученна11видахфорофитов,произрастающихвтаежныхлесахреспубликиУчитывалинетолькооблигатныхэпифитов,акомплексвидов,включающийпредставителейразличныхэколого-субсграгныхгрупп.Всегоотмечено389видовлишайников,обитающихнакоредревесныхпород.Анализируяколичественныйсоставэпифитов,можноотметить,чтомелколиственныепороды(особенноосинаиива)обладаютболеебогатымнаборомвидоввсравнениисхвойными.Связаноэтовпервуюочередьсфизико-химическимисвойствамикорыфорофитов.СредихвойныхдеревьевмаксимальноечисловидовотмеченонаPiceaobovataсамойраспространеннойпородевлесахтаежнойзоны.Приобщемпреобладаниинакипнойбиоморфывсложенииэпи-фитныхсообществпрактическинавсехвидахфорофитовпрослеживаетсятакаязакономерность:хвойныедеревьянаиболеебогатыкустистыми,амелколиственныелистоватымилишайниками. Наибольшимсходствомвидовогосоставаэпифитныхлишайниковобладаютосинаиива(Kj=0.64),иваибереза(Kj=0.37),рябинаиольха(Kj=0.37).Хвойныедеревьяимеютнаиболееблизкийнаборвидовлишайниковизлиственныхпородсберезой,анаиболееудаленный—сольхойиивой.Наибольшейспецифичностьювидовогосоставаотличаютсяель(26видов,17.2%общегочиславидов),осина(25,13.0%),сосна(21,19.1%),береза(11,6.6%)ипихта(6,5.5%).Дляостальныхфорофитовлихеноспецифичностьзначительнониже(1-2вида),адляивы,рябины,липы,черемухиневыявлена.Экологическиегруппылишайниковпоотношениюктемпературномурежимуивлажности.Лидируютмезофиты(289видов,68.4%общегочиславидов)игигромезофиты(109видов,25.4%).Участиепредставителейдругихгрупп(гигрофиты,психрофиты,ксеромезофиты,криофиты,ксерофиты)незначительноисоставляетменее2%.
Глава 2 Drosophilamelanogaster как модельный объект в исследованиях биологической активности веществ
2.1 Биология и генетика Drosophilamelanogaster
Drosophilamelanogaster,такжеимеетназваниеплодовая,банановая,уксуснаямуха.КлассInsecta,отрядDiptera,семействоDrosophilidae.Вприродеобитает«дикийтип»дрозофилы(нормальный).Наиболеечастоиспользуетсявгенетическихэкспериментах.Всовременнойнаучнойлитературепобиологиионачастоупоминаетсякакпросто«дрозофила»или«плодоваямушка».НасекомоебылопричисленокродуDrosophilaморфологически,тогдакаксовременныегенетическиеисследованияотносятеёкродуSophophora
Удрозофилыжёлто-коричневаяокраскаспоперечнымичернымикольцамипоперёкживотаикрасныеглаза(рис.1).Половойдиморфизмвыраженярко:самцызаметноменьшесамок,атакжеихзадняячастьтелатемнее.Самкивдлинуоколо2,5мм,длянеопытногочеловека,пытающегосяразличитьсамцовисамоксприменениеммикроскопа,возможно,наиболееотличительнойотметкойбудет,являетсягруппаостроконечныхволос,которыеокружаютанусигениталиисамца. Удрозофилыжизненныйциклзависитоттемпературы.Притемпературеравной25°Cциклсоставляет10дней,апри18°C-примерновдваразабольше.Самкиоткладываютяйцавзагнивающийфруктилидругойорганическийматериал.Всреднемоднасамкаоткладываетоколо400яиц(эмбрионов),каждоеизкоторыхоколо0,5ммвдлинуЧерез24часаяйцараскрываются.Вылупившиесяизнихличинкирастутнапротяжении5дней,приэтомонидваждылиняютзаэтовремя:через24и48часовпослерождения(Личинкипитаютсямикроорганизмами,которыеразлагаютфрукт,атакжеисамимсахаром,содержащиесявофрукте.Потомличинкизакупориваютсявпупарийипретерпеваютпятидневнуюстадиюметаморфоза,врезультатекотороговозникаютвзрослыеособи
Первоеспариваниеусамкиможетпроизойтинеранеечемчерез12часовпослепоявленияизкокона.Самкисохраняютспермуотсамцов,скоторымиониспариваются,дляиспользованияеепозже.Именномухуженскогополанужноотобратьдоеёпервогоспаривания(тоестьдевственнуюсамку)иубедиться,чтоонаспариваетсятолькосконкретнымсамцом,которымвыбрандляэксперимента.Оплодотворённаясамкаможетбыть«возвращенавдевственницы»путёмдлительнойинкубациипритемпературе10°C.Этатемператураубиваетспермудрозофилы.
ГеномD.Melanogasterсодержит4парыхромосом:X/Yпараитриаутосомы,маркируемыхкак2,3и4.Четвёртаяхромосоматочковиднаяиврядеисследованийеёнепринимаютвовнимание;X(илипервая),2и3-яхромосомы--метацентрические.Геномсостоитизпорядка132миллионовоснованийиприблизительно13767генов.Внастоящеевремягеномсеквенированианнотирован.
Кариотип:8хромосом(2n)[Raschидругие,1971].
Геном:0,18(0,12-0,21)пг[DetailedRecordfor Drosophilamelanogaster ].
ДрозофиламсвойственноXY-определениепола.Важнойиотличительнойчертоймеханизмаопределенияполадрозофилотчеловекаявляетсято,чтонаполвлияетненаличиеY-хромосомы,аотношениечислаХ-хромосомкчислуаутосом.Вдальнейшем,имеетсяввидугаплоидныйнабораутосом(n=4).Еслиотношениеравно1,тоособьразвиваетсявсамку,аеслиравно1/2--всамца.Принарушенияхобразуютсябесплодныеособи.ЕслиотношениеX-хромосомкаутосомампромежуточноемеждуединицейи1/2,тоэтоинтерсексы,еслиотношениеменьше1/2,тоэтосуперсамцы,априотношениибольше1образуютсясуперсамки.НаличиеY-хромосомыникакневлияетнапол,новнейнаходятсягены,ответственныезасперматогенез.Поэтомусамцыбезнеестерильны(табл.2).
В1971годуРонКонопкаиСеймурБенцеропубликовалиработу,озаглавленную«Clockmutantsof Drosophilamelanogaster ».Вэтойработебылиописаныпервыемутации,влияющиенаповедениедрозофилы.Вприродныхусловияхмушкидемонстрируютактивныйритмспериодомпримерно24часа.Учёныенашлимутантовсболеебыстрымииболеемедленнымииспорченнымиритмамижизни--мушек,которыедвигалисьиотдыхаливпроизвольныеинтервалывремени.Исследованиянапротяжении30летпоказали,чтоэтимутации(идругиепохожие)затрагиваютгруппугеновиихпроизводные,отвечающиезабиохимическиеилимолекулярныечасы.
2.2.Питательнаясредадляподдержанияжизни Drosophilamelanogaster
Дляподдержаниялиниинеобходимополучатьрядпоследовательныхпоколений,сохраняяихгомозиготность.Существуетопасностьпотерятьлиниювследствиегенетическогозасорениякультурыилипоявленияпле-сенинаповерхностипитательнойсреды.Засоренияможноизбежатьпутёмпостоянногоконтроляиоценкичистотылинииприкаждомпассажемух,используемыхдлядальнейшегоразмножения.Образованиеплесениможнопредупредитьпутёмсоблюденияправиласептикииантисептикивпроцес-сеприготовленияпитательнойсреды.Если,несмотрянаэтоплесеньпоя-вилась,отнеёможноизбавитьсяпутёмрядапересевакультурыдрозофилынасвежуюпитательнуюсреду.Просмотрмухпроизводитсятогда,когдаонинаходятсявнаркотизи-рованномсостоянии.Наркотизацияпроизводитсявэфиризаторе(морил-ке).Наркотизированныемухимогутоставатьсявсостояниинаркозаоколо5минут.НаркотизациямухпроизводитсяследующимобразомПробиркаснаходящимсявнеймухамиосторожновстряхивается(дномоладонь)дотехпор,покавсемухинеокажутсянаднепробирки.Вэтотмоментоткрываетсяпробкаэфиризатораипробиркасмухаминадвигаетсянанего.Затемпробиркаиэфиризаторпереворачиваютсятак,чтоэфириза-торнаходитсявнизу,ипостукиванием(поегодну)мухисгоняютсянадно.Вэтотмоментпробкаэфиризаторазакрывается,иэкспериментаторждёт,поканеперестанутдвигатьсявсеособивпробирке.Тогдаэфиризаторот-крываютивысыпаютвсехмухнаматовоестеклодляанализа.Еслимухиначнутдвигатьсяраньше,чембылапроизведенаихоценкаианализ,ихза-крываютчасовымстеклом,подкотороеподводитсянебольшоеколичествоваты,смоченнойэфиром.Мухможнопересыпатьизпробиркивпробиркубезнаркотизации.Влабораторныхусловияхупотребляютсяпробиркивысотой7,5сми3смдиаметром.Втакуюпробиркуналиваетсясреда,слойкоторойсостав-ляет1,0–1,5см.Наэтоколичествосредывпробиркупомещаютнеболее5самокитакоежеколичествосамцов.Прибольшемколичествесамоквоз-растаетопасностьперенаселения,врезультатекоторогоплодовитостьмухснижается.Еслилинияобладаетнизкойжизнеспособностьюиплодовито-стью,следуетувеличитьколичествосамцовврасчётенаоднусамку.Воизбежаниевозможностипотерилинии,каждуюнеобходимовестивне-сколькихпробирках(неменее5–20).Однасамкаможетотложитьдо200яиц,но,втечениепервых1-2су-токпослевыходаизкуколки,самкиоткладываюточеньмалояиц.Кладкаяицлучшевсегопроисходитнасреду,накоторойдостаточнохорошопро-19рослидрожжи;оптимальнойсчитаетсясреданеболее1-2днейприготов-ления.Использованиеболее«старой»средынецелесообразно.Припроведенииопытовпоскрещиваниюсамцынаходятсявместессамкамиоколо4–5суток.Послеэтого,воизбежаниеперенаселения,роди-тельскоепоколениеудаляетсяизпробирок.
Существуютразличныерецептыпитательныхсреддлядрозофилы(Н.Н.Медведев,1966идругие),основнымикомпонентамикоторыхявля-ютсясахар,дрожжи,маннаякрупа,водаиагар-агар.Втаблице2.1.1приводитсяодинизнаиболеераспространённыхииспытанныхвусловияхлабораторногопрактикумаразличныхуниверсите-товрецептовпитательнойсредыдлядрозофилыврасчётеналюбоеколи-чествопробирок.Всоставпитательнойсредымогутдобавлятьсядругиекомпоненты:изюм,бананы.
Составпитательнойсредыдлядрозофилы(врасчётенаопределённоеколичествпробирок)
Количествоагар-агараможетбытьуменьшеноилиувеличенона1–2гна100пробироквзависимостиотегокачества.Критерий:среданедолжнаразливатьсяивытекатьприработесмухами.
2.3Продолжительностьистрессоустойчивость Drosophilamelanogaster
Дрозофилаявляетсяудобнымобъектомдляисследованиямеханизмовстаренияипродолжительностижизни,втомчислеирадиационногостарения.Формакривыхвыживанияразличныхвидовживотных,представленнаявбезразмерныхвеличинах,практическиодинакова.Этотфактсвидетельствуетобуниверсальностифундаментальногомеханизмастарения.Посколькусоматическиетканиимагодрозофилысостоятизпостмитотическихклеток(исключениесоставляютнекоторыеинтерстициальныеклетки),онаподходиткакмодельмеханизмовстарениявпостмитотическихклетках.Втожевремяпостмитотическоесостояниесоматическихтканейвзрослыхдрозофилвопытахпоизучениюрадиационногостаренияпозволяетизбежатьвнедренияврезультатытакихнежелательныхфакторовкакзлокачественныеопухолиилилучеваяболезнь.Постмитотическоесостояниеимаго,какпредполагается,обусловливаеттакжебольшуюрольапоптозавстаренииудрозофилы.
Средняяпродолжительностьжизни Drosophilamelanogaster (приоптимальныхусловиях)составляет35-60дней.Показано,чтосредняяимаксимальнаяпродолжительностьжизниимагоприидентичныхусловияхсодержанияварьируетдо30%.Подобноеотмечалосьвпостоблученныхпоколенияхдрозофилыпослеоднократноговоздействияионизирующейрадиацией. Продолжительностьжизниособиопределяетсястарением.Старение-физиологическийпроцесс,сопровождающийсявозрастнымиизменениямиворганизме,характеркоторыхнаследственнозапрограммирован.Этиизмененияограничиваютадаптационно-компенсаторныереакцииорганизма,уменьшаютегоустойчивостькстрессу,дестабилизируютсвозрастомжизненныефункциииприводятксмерти. Апоптозиграетсущественнуюрольвразвитии,тканевомгомеостазеистарении[61].Удрозофилыпрограммированнаягибельклетокпроявляетвсесвойства,характерныедляэтойформыклеточнойгибели:фрагментациюядра,разрезаниеДНКнаолигонуклеосомальныефрагменты,блебинг(пузырение)плазматическоймембраныиобразованиеапоптотическихтел.Морфологическаяидентичностьапоптозадрозофилыпрограммированнойгибеликлетки,наблюдаемойудругихорганизмов,предполагаетобщиемеханизмырегуляции.
Рольапоптозавстарениицелостногоорганизмаобсуждаетсядавно.Наданныймоментпоказано(см.табл.2),чтостарениемногихтиповклетокассоциированосизменениемихчувствительностикапоптозу.
Апоптозудрозофилыпроисходитвтечениевсегоразвития,начинаяс11эмбриональнойстадии(около7часов),онобнаруживаетсявнервнойимышечнойсистемеупостметаморфозныхмолодыхимаго,атакжеувзрослыхистареющихмух.
2.3 Влияниедозионизирующегооблученияна Drosophilamelonagaster
Исследованиевлиянияионизирующейрадиациинапродолжительностьжизниведетсяуженесколькодесятилетийвразличныхлабораторияхмира.Темнеменее,несмотрянаобилиегипотезомеханизмахрадиоиндуцированногостарения,ниоднаизнихнезанялалидирующегоположения.Большинстворазнообразныхгипотезрассматриваеткакой-либоодинмолекулярно-клеточныйпроцесс(повреждениеДНК,биолипидов,митохондрий)вкачествепервопричиныявления,протекающегонаорганизменномуровне.Однако,нанашвзгляд,многиеизнакопленныхнынеотрывочныхданныхигипотезвыстраиваютсявцелостнуюкартину,охватывающуюпроцессрадиоиндуцированногостарениясмолекулярногодоорганно-тканевогоуровня.Предполагаяважнуюрольдестабилизациигеномаиапоптотическойгибеликлеткивконтроленадпродолжительностьюжизни,мысчитаем,чтоиндукцияданныхпроцессовионизирующейрадиациейможетсущественноускоритьестественноестарение,посколькудерегуляцияапоптозаистабильностигеномаприводяткразличнымфизиологическимнарушениям.Гибельилидисфункциямножестваразличныхтиповклеток,особенновтканяхсослабойпролиферативнойактивностью(котораяктомужеснижаетсясвозрастом,каквслучаесиммуннымииэндокриннымиклетками),либовтканяхсотсутствиемпролиферации(вслучаеснервными,мышечнымииполовымиклетками)приводиткстойкимфунк-циональнымизменениям.Многиеизтакихизмененийрассматриваютсянекоторымиавторами[8],каксимптомыстаренияорганизма(гормональныеииммунныесдвиги,дегенеративныезаболеваниянервнойимышечнойсистем,снижениерепродуктивнойспособности).
ЛюбойживойорганизмявляетсяоткрытойсистемойивусловияхпостоянноменяющегосявзаимодействиявнешнейивнутреннейСредыоннеможетоставатьсянеизменным(Фролькис,1992).Поэтомуэндогенныефакторытакилииначевносятсвойвкладвизменениедлительностижизни.Средимножествафакторов(пищевых,химических,температурных)мырассмотримлишьмалыедозыионизирующегоизлучения.Преждечемперейтикрассмотрениюихсвязиспродолжительностьюжизни,попытаемсяопределитьсамопонятиемалыхдозизлучения.Сфизическойточкизрениямалыедозысоответствуютодномусобытиюпролетачастицысквозьзаданныйчувствительныйобьем(Гераськин,1995б).Однакоинтересующегонасоднозначногобиологическогоопределенияпонятиямалыхдозневыработано.Видимоэтосвязаностем,чтовнастоящеевремянесуществуетединойобщепринятойконцепцииихбиологическогодействия(Гераськин,1995а).Поэтомумыостановимсянаопределениималыхдозкакнеприводящихксоматическойгибелиорганизма(Зайнуллин,1996).Темнеменее,ониоказываютвоздействиенаклетки.Причемклеткареагируеткакединаясложная,иерархическиорганизованнаясистема(Гераськин,1995б),чтообусловливаетширокийспектрвозникающихповреждений.Принципиальнаярольвбиологическихэффектахионизирующейрадиациипринадлежитповреждениюгенетическихструктур:точковым(генным)иструктурным(хромосомным)мутациям(Дубинин,1966;Ауэрбах,1978;Ганассиидр.,1987;Моссе,1987.Мыужерассмотрелирольмутацийвклеточномстарении(см.1.2).Однаковдиапазонемалыхдозоченьмалавероятностьпоражениянаследственныхструктурврезультатенепосредственногопопаданияквантовизлучения.Поэтомуособоезначениеимеетопосредованноевлияниенагеномврезультатеизмененияклеточногометаболизмапридействиирадиациинамембрануицитоплазму(Лобашев,1976;Кузин,1970,1980).Образующиесярадикалыкрайнереакционноспособны(Зотин,1993).Свободныерадикалылегковзаимодействуютдругсдругомилисдругимимолекулами,вовлекаяихвцепныереакции(Дубинин,1966;Литошенко,1992;Моссе,1990;Тихомироваидр.,1994).Ониповреждаютмолекулылипидов,белков,ДНК,индуцируютобразованиесшивокмеждумакромолекуламипотипушиффовыхоснований,ускоряютразрушениетеломерныхпоследовательностейхромосом(Зотин,1992,1993;Литошенко,1992;Оловников,1992).Предполагаемоезначениеэтихповрежденийвпроцессахстарениянамиужерассмотрено(см.разд.1.2).Какследствие,происходитмодификацияфункционированияклеточныхструктур,приводящаякперерождениюклеток(развиваютсяновообразованияилейкозы)илиихгибели(возникаютдегенеративныеизмененияорганов),чтовконечномсчетеиопределяетпродолжительностьжизни(Москалев,1991).Влияниемалыхдозионизирующегоизлучениянапродолжительностьжизниможетсущественномодифицироватьсяпроцессамирепарации(Гераськин,1995б)ивитаукта(Фролькис,1992),которыеиногданетольколиквидируютпоследствияповреждений,ноимогутпереводитьсистемунаболеевысокийуровень(Фролькис,1992),когдапродолжительностьжизниувеличивается.Такимобразом,действиеионизирующейрадиациинапродолжительностьжизниимееточеньсложныйкомплексныйхарактер.Онаможетнетолькоуменьшать,ноиувеличиватьеевпределахфлуктуаций,характерныхдляданноговида(Москалев,1991).
2.4 Факторы влияющиенапродолжительность жизни
Ограниченностьпродолжительностижизниистарениепредставляютсобойуниверсальныеявления.Продолжительностьжизниопределяетсявзаимодействиемгенетическихфакторовифактороввнешнейсредыиможетсильноотличатьсявразныхпопуляцияхиуразныхособейодноговида.Изучениегенетическихфакторов,лежащихвосноветакойвариабельности,представляетбольшойинтересдляпониманияпричиниусловий,обеспечивающихвысокуюпродолжительностьжизни.
Искусственноепродлениесветлойчастисутокприводиткувеличениюскоростистаренияикуменьшениюпродолжительностижизни(ПЖ)плодовоймушки Drosophilamelanogaster имышей(Москалевидр.,2006;Anisimovetal.,2004;Majercak,2002.;Massieetal.,1991;Massieetal.,1993;Sekelskyetal.,2000).Однакомеханизмыэтогоявленияизученыслабо.Втожевремяизвестно,чтопроцессыциркаднойритмичностипозвоночныхживотныхрегулируетгормонэпифизамелатонин(N-ацетил-5-метокситриптамин),который,крометого,оказываетвыраженноеантиоксидантноедействие(Анисимовидр.,1997;Анисимов,2003;Anisimovetal.,2006;Armstrongetal.,1991;Pierietal.,1995).По-видимому,умлекопитающихонучаствуетврегуляциипроцессовстарения.Например,длительноевведениемелатонинастарыммышамзамедляетвозрастзависимуюинволюциютимусаидегенерациюжелтогопятна(Sainzetal.,1995;Yietal.,2005).Известно,чтопристаренииорганизмамлекопитающихнаблюдаетсяпостепенноеснижениебиосинтезамелатонина,чтоявляетсяследствиемуменьшенияадренергическойиннервациииколичестваβ-адренергическихрецепторовнаповерхностипинеалоцитов(Pappollaetal.,1997).Вкачествеантиоксидантамелатонинподавляетобразованиеокисленных(карбонилированных)формбелковизамедляетперекисноеокислениелипидов(Anisimovetal.,1997;Bonillaetal.,2006).Благодарясвоимантиоксидантнымсвойстваммелатонинприводитквыраженномуподавлениюапоптоза.Например,онповышаетэкспрессиювнервнойтканигеновMn-иCu,Zn-Sod,защищаянейроныотапоптоза,вызванногоактивнымиформамикислородаинакоплениемCa2+.Мелатонинподавляеттакжеапоптозтимоцитов(Pappollaetal.,1997;Provincialietal.,1996).Врядеэкспериментовпоказано,чтовведениемелатониназамедляетпроцессыстаренияипродлеваетжизньмодельнымживотным,например,мышам(Pierpaolietal.,1994),крысам(Oakninbendahanetal.,1995)идрозофилам(Bonillaetal.,2002;Coto-Montesetal.,1999).В
2.5Стрессоустойчивость Drosophilamelanogaster
Род Drosophila содержитоколо1500описанныхвидовплодовыхмушек,которыезанимаютразнообразныеэкологическиениши,включаялеса,пустынииантропогенныетерритории.С1-йполовиныXXв.такиевидымушек,как D.melanogaster,D.pseudoobscuraиD.virilis, используютвкачествемодельныхобъектовгенетики,физиологии,экологиииэволюции.Насегодняшнийденьниоднадругаягруппаорганизмовнеимееттакойчеткоопределеннойфилогенииитакогобольшогочислапубликацийвразныхобла
стяхбиологии.Посленедавнегозавершенияполногеномногосеквенирования12видовдрозофил(D.melanogaster,D.pseudoobscura,D.ananassae,D.erecta,D.grimshawi,D.mojavensis,D.persimilis,D.sechellia,D.simulans,D.virilis,D.willistoniиD.yakuba)появилисьвозможностисопоставлятьразличныеаспектыэкологиииэволюционнойбиологиивидоводногородасособенностямиихгенома.Учитываяотносительнокороткийжизненныйцикл,плодовыемушкиродаDrosophilaмогутбытьиспользованыкакуникальныемодельныесистемыдлясравнительныхисследованиймеханизмовконтроляпродолжительностижизни(ПЖ)наразныхуровняхбиологическойорганизации.ПЖдрозофилыможетбытьувеличенаспомощьюгенетическихманипуляцийифармакологическихвмешательств.ПриэтомнаблюдаютвзаимосвязьПЖстакимипоказателямижизнеспособности,какплодовитостьистрессоустойчивость.
2.6Влияниеголоданияна Drosophilamelanogaster
Способностьживотныхизменятьметаболизмвответнапостоянноменяющиесяусловияокружающейсредынеобходимадляихсуще-ствования.Функцииорганизмаусловноможноразделитьнанесколькогрупп:выживание,размножение,ростиразвитие.Вусловияхсограниченнымиэнергетическимиресурсамиорганизмынемогутодновременномаксимальноудовлетворитьвсесвоипотребности(Boggs,1994;Zera,Harshman,2001).Накакие-тофункциивопределенныймоментвременивыделяетсябольшеэнергии,втовремякакснабжениересурсамидругихфункцийуменьшается.Так,дляплодовыхмушекDrosophilamelanogasterбылопоказаносопряжениепризнакаустойчивостикголоданиюифункцииразмножения.ВлинияхD.melanogaster,селектируемыхвтечениенесколькихпоколенийпопризнакуустойчивостикголоданию,самкиоткладываютменьшеяицвпервые5днейжизнипосравнениюссамкамиизстандартныхлабораторныхлиний(Wayneetal.,2006).Вдругихэкспериментахустановлено,чтопроцессоогенезауD.melanogasterзначительнозамедляетсяпринедостаткебелковогопитания(Drummond-Barbosa,Spradling,2001).Известно,чтовнормевяичникеD.melanogasterможетпроисходитьзапрограммированнаягибельклеток(апоптоз)вдвухконтрольныхточках(checkpoint)(рис.1),однаизкоторыхнаходитсявгермарии,адругая–ввителярии,на7–8-йстадииоогенеза(Giorgi,Deri,1976;Drummond-Barbosa,Spradling,2001).Обнаружено,чтоприголоданииколичествояйцевыхкамер,подвергающихсяапоптозу,вобеихконтрольныхточкахувеличивается(DrummondBarbosa,Spradling,2001).Продолжительностьжизни(ПЖ)D.melanogasterвусловияхголоданиязначительноснижается.МаксимальнаяПЖмухсоставляетвсреднем50–80дней(Grotewieletal.,2005),втовремякакПЖмухприголоданииможетколебатьсяот20часов(усамцовлинийD.melanogaster,чувствительныхкголоданию)до8дней(усамоклиниимух,селектируемойнаустойчивостькголоданию)(Rion,Kawecki,2007).Приисследованииреакцииорганизмовнастрессбольшоезначениеимеютусловияпостановкиэксперимента.ВнастоящеевремявработахпоизучениюдействияполногоголоданиянажизнедеятельностьD.melanogasterиспользуютсядвемодификацииэкспериментальныхусловий.Согласнооднойизних,мухипомещаютсявпустуюпробирку,соединеннуюснебольшойемкостью,содержащейвлажнуювату.Пробиркаиемкостьразделяютсямарлей,чтообеспечиваетповышеннуювлажностьвпробиркесмухамивотсутствиедоступакводе(Serviceetal.,1985;Harcombe,Hoffmann,2004;Hoffmannetal.,2005;Telonis-Scottetal.,2006).Согласнодругоймодификацииэксперимента,насекомыевпробиркахнепосредственноконтактируютсвлажнойватойиликормом,состоящимтолькоизагарозыиводы(Wigglesworth,1949;Harbisonetal.,2005;Baueretal.,2006;Brownetal.,2009).Сцельювыясненияадекватностиобоихметодоввнастоящейработебылпроведенсравнительныйанализвлиянияэтихдвухвариантовусловийголоданиянапродолжительностьжизнииморфологиюяичников D.melanogaster.
2.7Влияние температуры на Drosophilamelanogaster
Вопросыадаптацииорганизмовкконкретнымусловиямсуществованиядлительноевремяпривлекаютвниманиемногихспециалистов.Приэтомсамтерминадаптациятрактуетсякрайнешироко,зачастуюспротивоположныхпозиций.Так,Э.Лекявичус(1986)считает,чторазныеподходыкпониманиюадаптации–отпроцессовзакаливанияребенкаидоприобретениявовремяэволюцииновыхгенетическиобусловленныхсвойств–дажеполезны.Поегомнению,данныйподходспособствуетсинтезузнаний,посколькувлюбомслучаеадаптацияпредусматриваетповышениеприспособленияорганизма.Однойизтеорий,объясняющихмеханизмыадаптацииорганизмачеловекаиживотныхкизменениямусловийсуществования,являетсятеорияГ.Селье(1979)орешающемзначениистрессаввозникновенииадаптациииоткрытыйимнеспецифическийсиндром.Насегоднясуществуетмнение,чтострессявляетсяважныминструментомэволюции,совершающейсявэкстремальнойсреде,–онвыступаетвроликакфактораотбора,такисвоеобразногогенератораизменчивости(Маркель,2008).П.К.Анохин(1973)рассматривалпроцессадаптациикакформированиесоответствующихфункциональныхсистеморганизма.Однаконеясно,насколькоуказанныеконцепцииприменимыковсемживотным,вчастности–кнасекомым.ИсходяизпредставленийА.М.Уголева(1985)обобщностифункциональныхблоковпрактическивсехживыхорганизмов,можнопредположитьналичиесхожихзакономерностейводномизнаиболееважныхжизненныхпроцессовуживотных–формированииприспособлений.Cчитается,чтопереведениенановыйпищевойсубстратнасекомыхприсозданииихискусственныхкультурсоставляетотдельнуюпроблему:онодостаточночастосопровождаетсяразвитиемобщегостресса,значительнымиизменениямиповедения,снижениемрезистентности,физиологическимиидажеморфологическимиизменениями(Чернышев,1996).Исходяизуказанного,актуальнымявляетсяизучениереакциилабораторныхкультурнасекомыхнастрессовыевлияния,втомчислеисвязанныесизменениемихпитания.Влабораторныхусловияхприоптимальныхтемпературах(24–25С)циклразвития Drosophilamelanogaster проходитвсегоза9–10дней.Длительностьразвитиясоставляет:яйцо–1день,личинка–4,5-5дней,куколка–3,5-4,5днейипродолжительностьжизниимаго–25-30дней.Всеэтоспособствуетактивномуиспользованиюданногообъектавкачествемодельноговидадлясамыхразнообразныхисследований(Васильевидр.2007;Зиновьеваидр.,2008Биология…,2009),сейчасеетакжерассматриваюткакперспективныйвиддлябиоиндикационныхисследований(Петухова,2005;Гарипова,2009).Нанашвзгляд,дрозофиламожетбытьприемлемымобъектомтакжеидляизученияадаптационныхпроцессов,вчастностикизменениямтрофики.Вприроделичинкидрозофилживутпреимущественновразлагающихсяорганическихостатках,фруктахилигрибах(тоесть,выступаютпреимущественнодетритофагами).Вцелом,биологиякакличинок,такиимагодрозофилтесносвязанасопределеннымивидамидрожжейигрибов.Дажепредставителиоднойвидовойгруппымогутотличатьсяпоспособностииспользоватьразныевидыдрожжей.Приэтомбактериинеспособныподдерживатьнормальноеразвитиеплодовыхмушек(Хавинсонидр.,2000).Объясняетсяподобнаязависимостьдрозофилотдрожжейихнеспособностьюсамостоятельновырабатыватьэкдизон–гормонлиньки,безкоторогополноценноеразвитиестановитсяневозможным.Источникомпредшественниковэкдизонавыступаетпища,преимущественнодрожжи,которыеобязательноиспользуютсявкормовыхсубстратахприискусственномвыращиваниидрозофил(Инге-Вечтомов,1997).
ИзработыКоржаА.П.Вовремяпроведенияисследованийбылоопределено,чтоиспользованиетемпературногорежима31±1Сдлясодержаниядрозофилприводиткприостановкеихразвитияивызываетдостаточнобыструюгибелькакимаго,такиличиноквпервыетроесуток.Особимутантныхлинийпритакихтемпературахдаженеоткладывалияйца.Такженеприемлемойявляетсяинизкаятемпература,котораяполностьютормозитразвитиеиразмножение Drosophilamelanogaster. Такимобразом,полноценноеразвитиедрозофилыприкритическихтемпературахоказываетсяневозможным–подобноенегативноевоздействиеприводиткгибелисоответствующихкультурнасекомых.Прииспользованиитемпературы25±1Снаибольшеезначениедляразвитияплодовоймушкиприобретаетиспользуемыйпищевойсубстрат.
Глава 3.Материалыиметоды
Дляэкспериментаиспользовалиособейлини