Практикум 4. Бактериологический метод. Выделение чистой культуры
Задание: законспектируйте нижеизложенный материал. Зарисуйте приведенные рисунки.
Выделение чистой культуры предполагает проведение трех этапов:
1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры;
3) определение чистоты выделенной культуры.
Получение накопительной культуры
Выделение чистой культуры будет успешным, если искомый микроорганизм присутствует в пробе (или в популяции) в достаточно высокой концентрации. Накопление представляет собой 1 этап, который позволяет выделить чистые культуры. Методы накопления имеютцелью добиться увеличения относительного количества данного микроорганизма за счет создания благоприятных условий для его роста ивыживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С.Н. Виноградским и М.Бейеринком. Сущность его заключается в создании элективных (т.е. избирательных) условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых(необходимых исследователю) микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешанной популяции.
Выделение чистой культуры
Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкойкультуры (метод предельных разведений). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить.
Получение изолированных колоний на твердой питательной средедостигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем(метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клетокмикроорганизмов каждая из них может дать начало изолированнойколонии одного вида микробов.
I. Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:
а) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;
б) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпательв чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культурыпо всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;
в) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;
г) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.
Через определенное время чашки достают из термостата и изучаютрост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдается сплошнойрост бактерий, в последующих чашках формируются изолированныеколонии.
II. Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высевбактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей скультурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде(рис. 1, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рис. 1, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рис. 1), а после очереднойстерилизации – в направлении Г (рис. 1).Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое числоколоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии. 
III. Последовательные разведения в твердой среде – самый простойспособ посева по чашкам, который заключается в том, что после инокуляции пробы (т.е. введения живых микроорганизмов) в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15 – 20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Минусом также является и тот факт, что бактерии некоторое время находятся всреде при температуре расплавленного агара (что негативно может сказаться на их росте).