Метод Циля-Нельсена
1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё карболовый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 25%-го раствора серной кислоты или 3 % солянокислого спирта в течение 3-х минут, и промывают несколько раз водой.
3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 1 минуту, промывают водой и высушивают.
При окраске по методу Циля — Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.
По Цилю-Нильсену красят мазки мокроты, содержимого желудка, других биологических жидкостей, а также гистологические срезы. Чтобы отыскать розово-красных бактерий на голубом фоне, надо иметь опыт, так как даже в обогащенном материале их немного.
Метод окраски по Нейссеру
• на фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2 - 3 минуты
• добавить раствор Люголя на 10 - 30 секунд
• промыть водой
• мазок докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 30 - 60 секунд
• промыть водой, высушить, микроскопировать
Зерна волютина имеют щелочную реакцию, поэтому воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма, имея кислую реакцию, воспринимает везувин и окрашивается в желтый цвет.
Метод Ожешко.
• на нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор HCl и подогреть на пламени 2-3 минуты
• кислоту слить, препарат промыть водой, просушить, зафиксировать, затем окрасить по Цилю-Нильсену:
• нанести на мазок карболовый раствор фуксина и подогреть до появления паров в течение 3 - 5 минут
• промыть водой
• нанести 5% раствор H2SO4 на 1-2 минуты
• промыть водой
• докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут
• промыть водой, высушить и микроскопировать
Раствор карболовой кислоты разрыхляет оболочку спор и тем самым повышает её тинкториальные свойства, при этом споры и вегетативные формы окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные формы обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а споры остаются красными.
Споры прочно удерживают карболовый фуксин и окрашиваются в красный цвет, цитоплазма бактерий обесцвечивается 5% серной кислотой и после докрашивания метиленовым синим приобретает синий цвет.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и зерна волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1мл воды, которая должна быть подщелочена до рН – 7,2.
1. Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол;
2. Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24ч);
3. Промыть водой (рН – 7,2) и высушить;
Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в краснофиолетовый.
Методы выделения чистых культур бактерий.
Посев петлей. Посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки. Избыток снимают, поколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по всей поверхности агара.
Посев шпателем. Материал наносят петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности среды.
Посев тампоном. Тампон и исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.
Посев на секторы. Дно чашки делят на секторы. Посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, что бы штрихи с одного не переходили на другой.
Посев газоном. 1мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют по всей поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой. После посева чашки закрывают и кладут вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, на пробирках – в верхней части. При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал по стенке пробирки. После чего смывают его средой.
Люминесцентная микроскопия — оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нему. Источниками света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления или лампы накаливания точечного типа. Яркое цветное свечение объектов на темном фоне обеспечивает высокий контраст. Оптико-механическая промышленность выпускает специальные люминесцентные микроскопы и отдельные осветители.
Лишь немногие биологически значимые вещества имеют выраженную собственную люминесценцию в видимой области спектра. К ним относятся некоторые пигменты (хлорофилл, порфирины, липохромы), витамины А и В2, алкалоиды (берберин, хинин и др.), антибиотики (тетрациклины и др.), химиотерапевтические и токсические вещества. Проникновение этих веществ в органы и клетки, их распределение и превращения могут быть прослежены при помощи прижизненной люминесцентной микроскопии. Чаще в люминесцентной микроскопии используют люминесцентную «окраску» специальными веществами (флюорохромами), избирательно придающими тонким структурам клетки и тканей способность люминесцировать (люминесцентная цитохимия).
флюорохром акридиновый оранжевый применяют для контрастирования ядерных структур, выявления нуклеиновых кислот, мукополисахаридов, для обнаружения микробов и крупных вирусов, для цитодиагностики, в том числе распознавания в мазках раковых клеток;
аурамин 00 служит для выявления кислотоустойчивых бактерий (туберкулеза, проказы), риккетсий и некоторых вирусов; примулин — для флюорохромирования элементарных телец вирусов и различения живых и мертвых клеток; фосфин ЗК, нильский голубой и бензпирен — для локализации липидов в клетках.
Особое значение в люминесцентной микроскопии придается люминесцентно-иммунологическим методам, основанным на применении люминесцентно меченных специфических сывороток (антител). Метчиком чаще служит флюорохром изотиоцианат флюоресцеина. Получаемый комплекс «антитело-флюорохром» позволяет быстро обнаруживать, идентифицировать и локализовать даже ничтожные количества соответствующих антигенов, в том числе вирусов, риккетсий, бактерий на фоне посторонней микрофлоры, а также выявлять специфические белки, ферменты, полисахариды в клетках и тканях.
При люминесцентной микроскопии можно изучать первичную (ткани и органы человека и животных имеют нерезкую белесую, голубую или синюю люминесценцию) и вторичную люминесценцию клеток и тканей. Изучение вторичной люминесценции живых и фиксированных клеток и тканей (после их «окраски» флюорохромами) получило широкое распространение. При изучении живых клеток флюоресцирующие вещества применяют в очень малых количествах, не вызывающих токсического действия. В цитологических исследованиях Л. м. применяют при диагностике злокачественных новообразований в соскобах, пунктатах, мокроте, промывных водах. Этот метод позволяет быстро получить ярко окрашенный препарат, в котором атипичные клетки выделяются ярким свечением, оттенками цвета и структурой. Л. м. применяется и в гистохимии. Использование акридинового оранжевого позволяет выявить нуклеиновые кислоты, при этом ДНК дает зеленую, а РНК — красную флюоресценцию. Тот же флюорохром в нефиксированных срезах помогает выявить мукополисахариды, а при модификации этого метода — муцины. Фосфин 3R, родамин В, бензпирен и др. выявляют в срезах липиды.
Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико-химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток.
Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала.
При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.
Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой.
Основным ограничивающим фактором метода является то, что только малая часть падающего света в итоге формирует изображение, поэтому необходимо применять достаточно мощные источники света, что иногда приводит к повреждениям образца (сейчас иногда используют лазеры).
Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов — простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток.
Темнопольная микроскопия в последнее время используется в производстве компьютерных мышей[3] с тем чтобы обеспечить работу оптических мышей в том числе и на прозрачных стёклах, имеющих микроскопические дефекты или пыль на поверхности.
Используется для изучения живых бактерий в нативных препаратах "раздавленная" или "висячая капля".
Микроскопия в темном поле зрения основана на том, что лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя, поле зрения остается темным, а объект выглядит светящимся. Это достигается с помощью специального параболоид- или кардиоид-конденсора.
Фазово-контрастная микроскопия используется для изучения живых бактерий в нативных препаратах "раздавленная" или "висячая капля". При прохождении пучка света через неокрашенный объект (например, клетка бактерии) изменяется фаза колебания световой волны, что не воспринимается глазом. Чтобы изображение стало контрастным (видимым) необходимо превратить фазовые изменения световой волны в амплитудные, различимые глазом. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива.
При прохождении света через окрашенные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством; объективы заменяют на иммерсионные объективы-апохроматы.
Метод основан на интерференции света в плоскости изображения, обусловленной сдвигом по фазе при прохождении света через объекты различной оптической плотности. Для этого используется сменный набор фазовых колец в апертурной диафрагме и специальный конденсор. Для получения фазово-контрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути. Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их.
Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки, расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.
Фазово-контрастная микроскопия особенно популярна в биологии, поскольку не требует предварительного окрашивания клетки, из-за которого та может погибнуть.