Ф КГМУ 4/3-06/02
ИП №6 УМС при КазГМА
От 14 июня 2007 г
КАРАГАНДИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра молекулярной биологии и медицинской генетики
Методические рекомендации для семинарских занятий
(TBL)
Тема 30: Исследование структурных нарушений хромосом в соматических клетках методом кариотипирования.
Специальность: 5В130100– общая медицина
Дисциплина: Молекулярная биология и медицинская генетика
Курс: 1
Составители:
Кислицкая В.Н.
Татина Е.С.
КАРАГАНДА 2013
Обсуждена и утверждена на заседании кафедры.
Протокол № _01_ от «_02_» __09__2013
Зав. кафедрой ____________________Б.Ж. Култанов
Тема 30: Исследование структурных нарушений хромосом в соматических клетках методом кариотипирования.
Форма проведения: практическое (лабораторное занятие).
Микроскопические методы изучения хромосом человека применяются с конца XIX века. Цитогенетические методы предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом. Наиболее распространенным методом в цитогенетике человека является световая микроскопия. Электронная и конфокальная лазерная микроскопия применяется в современной цитогенетике только с исследовательскими целями. Во всей медико-генетической практике применяется световая микроскопия (главным образом в проходящем свете), включая люминесцентную микроскопию.
Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Каждый из этих объектов имеет преимущества и недостатки. Выбор объекта определяется целью исследования.
Большинство цитогенетических исследований выполняется на соматических клетках, поэтому остановимся на описании этих методов.
Объект исследования: кровь икостный мозг лабораторных животных.
Ход работы:
Для стимуляции методической активности животным за 2 ч до забоя вводят 2,5 мг/кг колхицина.
Всех животных забивать под эфирным наркозом методом неполной декапитации через 24 часа после введения препарата. У животного выделяется бедренная кость, из которой шприцом с небольшим количеством физиологического раствора вымывается костный мозг.
Осадить клетки центрифугированием, отбросить супернатант и ресуспендировать осадок в 5 мл гипотонического раствора 0,075 М КCI при 370С.
После 10-15 мин инкубации при 370С собрать клетки центрифугированием при 100g в течение 10 мин и отбросить супернатант, ресуспендировать клетки небольшом объеме (примерно 1-2 объёма клеточного осадка) гипотонического раствора KCI.
Медленно добавить 2 мл свежеприготовленного фиксатора (фиксатор должен охлажден) при постоянном помешивании (пипетировании пастеровской пипеткой, встряхиванием или с помощью вортекса).
Через 20 мин или более осадить клетки центрифугированием, отбросить супернатант и ресуспендировать клетки в 2 мл свежего фиксатора. Дать суспензии постоять при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
Осадить клетки центрифугированием при 100g в течение 2 мин, отбросить супернатант и ресуспендировать клетки в небольшом объёме (примерно 10-15 объёмов клеточного осадка) свежего фиксатора.
Для приготовления препаратов нанести суспензию по каплям на чистое холодное (40С) предметное стекло, наклоненное под углом 450; слегка покачивая стекло, дать суспензии растечься по поверхности и высушить на воздухе при комнатной температуре.
Обследовать препарат в фазово – контрастном микроскопе. Метафазные пластинки должны быть равномерно и без перекрывания распределены по поверхности стекла. Плотность клеток на стекле можно регулировать, меняя число капель суспензии или изменяя концентрацию клеток в суспензии.
Окрасить препарат краской по Гимза-Романовского в течение 1-15 мин; ополоснуть водопроводной водой и высушить на воздухе.
Приготовленные препараты микроскопируют. Анализу подвергают 100 метафазных клеток каждого животного.
Результаты представляют:
- общее число проанализированных клеток;
- процентное соотношение из них аберрантных;
- спектр аберраций и процентное соотношение их;
- значение X2 статистики соотношения нормальных и аберрантных метафазных клеток в подопытных и контрольных группах.
Реактивы: колхицин, эфир, физиологический раствор, гипотонический раствор КCI, ацетоорсеин, этанол, уксусная кислота, краситель Гимза-Романовского.
Приборы и оборудование: шприц, пастеровская пипетка, центрифуга, предметное стекло, фазово – контрастный микроскоп, термостат.
Значение: предложенное практическое занятие позволяет освоить методы определения хромосомных абберации т.е. количественные и качественные изменения хромосом. В зависимости от цели и метода окраски определяются числовые аномалии кариотипа, структурные нарушения хромосом, степень мутагенности факторов окружающей среды.