Острую токсичность изучали мышах при внутрибрюшинном пути введения. Опыты проводили на нелинейных беспородных белых мышах массой тела: самцы и самки 20-24 г. В каждой экспериментальной группе насчитывалось по 5 самок и 5 самцов. При внутрибрюшинном введении препарата мышам в дозе 0,063 мл/кг(Фото№2) через 30-40 минут у животных наблюдалось состояние возбуждения, дыхание учащенное. Спустя 1 час животные находились в заторможенном состоянии, передвижения по клетке ограничены. У части животных регистрировалась шаткая походка и слабая реакция на внешние раздражители.
Последующее наблюдение за животными всех групп не выявило изменений в общем состоянии опытных животных: состояние шерстного покрова, слизистых глаз, поведение животных, потребление пищи и воды не имело отличий от интактных животных.
Наблюдение за животными проводили в течение 14-ти суток. На 14-й день крыс и мышей подвергали эвтаназии путем передозировки углекислым газом. За сутки до эвантазии самцам под кожу подушечки левой задней лапы вводили по 0,05 мл 12% взвеси эритроцитов барана. В подушечку контрлатеральной (контрольной) лапы вводили такое же количество физиологического раствора. На следующий день после разрешающей инъекции животных забивал и производили забор периферической крови для определения уровня гемагглютининов к бараньим эритроцитам в сыворотке. Отрезали обе задние лапы по линии скакательного (пяточного) сустава (Рис.3) и взвешивали контрольную и опытную лапы для определения индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), который вычисляли по формуле:
.
Самок после забоя вскрывали, изымали селезенку и готовили суспензию из селезеночных клеток. Для этого полученною селезенку растирали ступкой, залили раствором Хэнкса(Рис. 3). Хорошо встряхнуть, добавить агарозную смесь и эритроциты барана. Полученный раствор поставить на водяную баню на 30 минут при температуре 45- 480 С. После этого разливаем полученную смесь по чашкам Петри, равномерно распределяя. После застывания отправляем термостат на 1 час при температуре 370С. Через час добавляем 3 мл раствора сухого комплимента морской свинки(1:5) и отправляем инкубироваться в термостат на 10 часов.
Рис 3. Растирание селезенки Рис 4. Отрезание задних лапок мышей
Тест Эймса. Принцип
Ames test или тест Эймса — генетический тест с использованием бактерий Salmonella Typhimurium в качестве тест объекта. Предназначен для оценки мутагенного потенциала химических соединений. Положительный результат в тесте означает, что химическое вещество может обладать канцерогенными свойствами. Так как малигнизация часто связана с повреждением ДНК, тест также используется как экспрессный метод оценки канцерогенного потенциала различных химических соединений, и как дополнение другого аналогичного метода — стандартного теста на грызунах. Методика была описана в ряде работ в начале 1970-х Брюсом Эймсом и его группой в Калифорнийском Университете, Беркли.
Методика постановки теста. В тесте используются некоторые штаммы бактерии Salmonella Typhimurium, которые несут мутации в генах, участвующих в синтезе гистидина. В тесте изучается возможность предполагаемого мутагена вызывать ревертивную мутацию данного гена, при которой штамм приобретает способность расти на среде, не содержащей гистидин. Предназначенные для тестирования штаммы подобраны таким образом, чтобы содержали обе рамки считывания и точковые мутации в генах ответственных за синтез гистидина, что позволяет обнаруживать мутагены путем воздействия на различные механизмы. Некоторые химические соединения крайне специфичны и поэтому вызывают реверсии только в одном или двух штаммах. Используемые в тесте штаммы также несут мутации в генах, ответственных за синтез липополисахарида, делая клеточные стенки бактерий более проницаемыми,. Кроме того, отсутствие некоторых генов, ответственных за репарационные процессы, делает тест более чувствительным. Ввиду коренных отличий между метаболизмом бактерий и млекопитающих в тесте может быть использована вытяжка из печени крыс для имитации эффекта обмена веществ, так как некоторые соединения, например бензпирены, не обладают мутагенной активностью, но их производные, которые образуются в процессе метаболизма, приобретают генотоксичность.
Бактерии высеваются на агарозную питательную среду в чашки Петри. Среда содержит небольшое количество гистидина. Этого количества гистидина в среде достаточно, чтобы обеспечить жизнедеятельность и рост бактерий в течение некоторого времени и дать возможность успеть за это время мутировать. После исчерпания гистидина, содержавшегося в среде, выживают только ревертивовашие колонии, которые приобрели способность синтезировать собственный гистидин. Контролем служат бактерии, посеянные на среде, не содержащей исследуемого мутагенного фактора. Инкубация проводится в течение 48 часов. Мутагенный потенциал исследуемого вещества оценивается пропорционально числу обследованных колоний.