Индукция синтеза ферментов

Лекция (мультимедиа)

 

Микроорганизм – специфический элемент биотехнологических систем.

Метаболизм, закономерности роста и развития микроорганизмов.

Получение экзо- и эндо- метаболитов.

(Слайд 1)

Содержание (Слайд 2)

Введение.

1. Строение бактериальной клетки.

2. Координация микробного метаболизма.

3. Закономерности роста и развития микроорганизмов.

4. Методы получения и совершенство-вания производственных штаммов микроорганизмов.

Заключение.

Литература (Слайд 3)

 

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М.: Мир, 2000.

2. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств.- М.: ВО «Агро-промиздат», 1990 г.

3. Самуйленко А. Я., Рубан Е. А. Основы биотехно-логии производства биологических препаратов.- Т 1, Т 2. – М., 2000.

4. Тихонов И.В., Рубан Е.А., Грязнева Т.Н. и др. Биотехнология.- Спб.- Гиорд.-2005.-790 с.

5. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов.- Ст. ГСХА, 1997.

Введение

(Слайд 4) Чтобы получить какой-либо биотехнологический продукт (вакцина, сыворотка, диагностический препарат, антибиотик, фермент, витамин и др), необходимы 4 основных элемента.

Важнейшей особенностью биотехнологического процесса является то, что реак­ции образования или разрушения различных продуктов осуществляются с помощью живых микроорганизмов. Они потребляют из окружающей среды вещества, растут, размножаются, выделяют жидкие и газообразные продукты метаболизма. Тем са­мым реализуются те изменения в живой системе (накопление биомассы или продуктов ме­таболизма, потребление загрязняющих веществ), ради которых проводят процесс культивирования, (Слайд 5) т.о. культуру микроорганизмов можно рассматривать как цен­тральный элемент биотехнологической системы, определяющий эффективность ее функционирования. (Слайд 6). Остальные элементы системы культивирования (ферментатор-культиватор, питательная среда, система контроля и управления и др.) подбирают или коструируют так, чтобы в максимальной степени обеспечить потребности при­меняемой культуры и стимулировать их функционирование в желаемом направле­нии.

Поскольку для ветеринарии производятся, в основном, противобактериальные и протиовирусные препараты, в данной лекции мы сконцентрируем внимание на бактериях-продуцентах как специфическом элементе биотехнологических систем, а вирусы рассмотрим в последующих лекциях курса, притом, что вирусы ничего не продуцируют, а только размножаются, и сегодня вспомним строение вирусов.

(Слайд 7) Выбор бактерий, как основного элемента биотехнологических систем обусловлен следующими факторами:

1. Клетки являются своего рода “биофабриками”, вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, угле­воды, витамины, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр. Многие из этих продуктов, крайне необходимые в жизни человека, пока недоступны для получения “небиотехноло-гическими” способами из-за дефицитности или высокой стоимости сырья или же сложности технологических процессов, особенно их использования в крупномас­штабном производстве;

2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 мин., дрожжевая - через каждые 1,5-2 часа, жи­вотная - через 24 часа, что позволяет за относительно короткое время искус­ственно нарастить на сравнительно дешёвых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, живот­ных или растительных клеток. Например, в ферментёре (аппарате для выращива­ния клеток) ёмкостью 100 м³ за 2-3 суток можно вырастить 10¹⁶ - 10¹⁸ микробных клеток. В процессе жизнедеятельности клеток при их выращивании в среду посту­пает большое количество ценных продуктов, а сами клетки представляют собой кладовые этих продуктов;

3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др. значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. При этом исходное сырьё для биосинтеза, как правило, проще и доступнее, чем сырьё для других видов синтеза. Для биосинтеза используют от­ходы сельскохозяйственной, рыбной продукции, пищевой промышленности, рас­тительное сырьё(например, молочная сыворотка, дрожжи, древесина, меласса и др.);

4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышлен­ных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования, доступность сырья, технологии переработки и т.д.

(Слайд 8) Бактерии относятся к прокариотам (безъядерным (предъядерным) организмам)), в их клетках нет диф­ференцированного ядра. Подавляющее большинство используемых в промышленно­сти бактерий-гетеротрофы; они нуждаются в органических источниках углерода и энергии. (Слайд 9).

(Слайд 10) Бактерии представляют собой одноклеточные микрооганизмы, имеющие шаро­образную форму (кокки) или цилиндрическую (палочки): палочки бывают прямые и изогнутые. Бактерии размножаются путем бинарного деления, при котором образу­ются две одинаковые клетки.

(Слайд 11) В микробиологической промышленности бактерии применяют, в основном, для получения вакцин, продуктов микробного синтеза (ферментов, органических кислот, антибиотиков и др.), средств защиты (растений) и т.д.

(Слайд 12, 13, 14, 15) Вирусы.

Вспомним строение бактериальной клетки.

 

Вопрос 1. Строение бактериальной клетки

 

(Слайд 16) Из курса микробиологии, вы хорошо представляете строение бактерий, поэтому вспомним об основных клеточных структурах, участвующих в процессах биосинтеза.

(Слайд 17) Микробная клетка покрыта снаружи клеточной стенкой. Клеточная стенка у бак­терий прочная и эластичная, как покрышка футбольного мяча. Подобно то­му, как мячу придаёт упругость надутая камера, клеточной стенке придает опреде­ленную упругость внутреннее содержимое клетки, окруженное цитоплазматической мембраной.

Клеточная стен­ка выполняет следующие функции:

1. Выполняет роль механического барьера. Защищает клетку от воздействий внешней среды, участвует в делении, придает клетке характерную форму, поддерживая в ней осмотическое давление.

2. Участвует в транспорте питательных веществ и метаболитов за счет того, что она проницаема для солей и других низкомолекулярных соединений, а через поры размером до 3,6 мкм, которые в ней имеются, проникают высокомолекулярные био­полимеры.

3. На поверхности клетки находятся рецепторы для фагов, бактериоцинов и др.

4. Структура и состав клетки определяют антигенную характеристику (Оi, Vi-антигены), а также отношение к красителям (Гр+, Гр-).

5. Нарушение целостности клеточной стенки ведет к гибели клетки или образованию L-форм и т.д.

(Слайд 18) Химический состав клеточной стенки бактерий уникален и состоит из пептидогликана (муреина), который представляет собой N-ацетил-Д-глюкозамин и N-ацетилмурамовую кислоту и специфические пептиды. Клеточная стенка, ответствен­на также за окрашивание по Граму. Способность или, наоборот, неспособность ок­рашиваться в темно-фиолетовый цвет при использовании метода, предложенного в 1884 г. Грамом, служит важным таксономическим признаком, с которым коррели­руют другие свойства бактерий.

Грамположительные бактерии отличаются от грамотрицательных:

1. По толщине муреиновой сетки - 40 слоев (30-70 % сухой массы);

2. Вместо мезодиаминопелилелийновой кислоты содержится 22-диаминопи-лелиновая кислота лизин;

3. Наличие тейхоевых кислот — цепи, состоящие из 8 — 50 остатков глицерола или рибитола связанных между собой фосфатными частицами, которые через фосфат связаны с муреином по типу амида.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) — тонкая (7-8 мкм) мембрана, расположенная под клеточной стенкой и отделяющая ее - от цитоплазмы. Ц.п.мл состоит из биомо­лекулярного слоя липидов, в которой включены белковые молекулы (т.н. мозаичная модель структуры мембраны). Липиды ориентированны неполярными концами внутрь, друг к другу, а полярными - наружу. Основные функции цитоплазматической мембраны следующие:

1. Играет важнейшую роль в обмене веществ, регулируя поступление веществ в клетку и обратно.

2. Является осмотическим барьером;

3. Транспорт веществ через ЦПМ осуществляется не только путем обычной молекуляр­ной диффузии (по градиенту концентрации). Вещества могут поступать в клетку и против градиен­та концентрации. Например, аминокислоты легко проникают из среды в клетку, да­же если их концентрация в цитоплазме в 100-200 раз выше, чем в окружающей сре­де. Имеются механизмы активного транс­порта, в которых участвуют специальные факторы.

4. ЦПД пронизана «мостиками» или канала­ми из белков и именно они служат порами, через которые осуществляется ре­гулируемый транспорт веществ.

5. Участие в процессе дыхания — на поверхности или внутри ЦПМ располагают­ся ферменты (например, цитохром расположен в на­ружном слое, а АТФ — синтетаза — на внутренней стороне мембраны).

6. Участие в процессе движения - т.к. жгутики прикреплены к ЦПМ.

7. Участие в формировании капсулы и делении клеток (образование первичной перетяжки при делении клеток).

(Слайд 19) Цитоплазма — основная масса клетки. Она заключена в оболочки клетки и представляет собой коллоидный раствор аминокислот, ферментов, углеводов, мине­ральных солей и многих других веществ в воде.

Нуклеоид — место в бактериальной клетке, где располагается двухцепочечная кольцевая ДНК и связанные с ней белки. Обеспечивает хранение и передачу генети­ческой информации. ДНК при делении клеток удваивается (реплицируется) и с неё транскрибируется информация на м-РНК.

Рибосомы - шаровидные структуры размером 15-35 мкм - содержат р-РНК и бел­ковый комплекс. На рибосомах протекает синтез белков, т.е. информация, записан­ная в ДНК в виде последовательности нуклеотидов, транслируется в последователь­ность аминокислот в молекуле белка.

Вакуоли и гранулы - в них запасаются резервные вещества клетки, чаще всего в виде валютина, жиров или углеводов.

Плазмиды – кольцевые молекцлы ДНК, в которых закодирована информация о 1-3 свойствах клетки. Есть только у бактерий.

(Слайд 20) Отличия эукариот от прокариотов.

 

Вопрос 2. Координация микробного метаболизма

(Слайд 21) В живых клетках протекает огромное число реакций, необходимых для роста, размножения и поддержания их жизнедеятельности. Большинство этих реакций носит ферментативный характер и протекает в присутствии специфических ферментов. Для нормального функционирования клетки необходима согласованность протека­ния всех реакций во времени и в пространстве. В каждый момент должны образо­вываться и действовать ферменты, которые катализируют реакции, нужные в данный момент развития клетки.

Практически все гены у бактерий функциональные, а у эукариот 2/3 не функциональные. Белок у бактерий синтезируется сразу весь и включается в метаболизм, а у эукариот образуются экзоны и интроны.

(Слайд 22) Координация микробного метаболизма осуществляется с помощью следующих механизмов регуляции:

1. Индукция синтеза ферментов;

2. Репрессия синтеза ферментов;

3. Ингибирование активности ферментов;

4. Активизация ферментов.

Первые два механизма обеспечивают регуляцию путем изменения концентра­ции того или иного фермента в клетке, вторые два — путем изменения активности уже имеющихся ферментов. Остановимся на каждом механизме подробнее.

Индукция синтеза ферментов

 

Все ферменты микробных клеток можно разделить на две группы:

1. Конструк­тивные

2. Индуцибельные.

К первой относятся ферменты, которые всегда имеются в клетке, независимо от фазы её развития и условий окружающей среды. Это фермен­ты, катализирующие наиболее важные метаболические реакции, например, катабо­лизм глюкозы.

Вторая группа включает ферменты, которые синтезируются лишь в определенных условиях, при наличии в среде вещества — индуктора. Чаще всего ин-дуктором синтеза фермента является его специфичный субстрат, но иногда может быть и другое вещество. Механизм индукции не позволяет транжирить энергию и питательные ве­щества на синтез ненужных, в данных условиях, ферментов.

Например, если клетки бактерий растут на среде с глюкозой, они почти не синтезируют амилолитические ферменты, однако при переносе на среду, где единственным источником углерода и энергии является крахмал, происходит индукция синтеза амилаз, необходимых для усвоения крахмала.

(Слайд 23) Наиболее подробно изучен механизм индукции синтеза ферментов (катабо­лизм лактозы) у Е.сoli.

Три гена, кодирующие аминокислотную последователь­ность трех ферментов катаболизма лактозы (В-галактозидазы, лактопермеазы и трансацетилазы), расположены в хромосоме последоватеьно и образуют совместно с промоторной и операторной областью lac-оперон.

В начале оперона, перед структурными генами, расположены регуляторный уча­сток молекулы ДНК, состоящий из промотора и оператора.

Промотр - это участок, к которому присоединяется РНК- полимераза (начало синтеза м-РНК).

Оператор – это участок, с которым связывается специальный белок - репрессор.

Синтез репрессора, в свою очередь, кодируется геном - регулятором. Белок - репрессор содержит два активных центра - один обеспечивает присоединение белка к оператору, а другой обладает сродством с молекулами индуктора.

(Слайд 24) В отсутствие индуктора белок - репрессор прочно связывается с оператором. Это препятствует продвижению РНК-полимеразы по нуклеотидной цепочке ДНК и блокирует транскрипцию структурных генов и синтез соответствующих ферментов. При наличии индуктора (для lac - оперона - это не сама лактоза, а аллолактоза) он (индуктор) специфично присоединяется к репрессору и изменяет его конформацию, что приводит к снижению сродства репрессора к оператору и освобождению оператора. Снимается блокировка продвижения РНК-полимеразы, начинаются транскрипция структур­ных генов и синтез ферментов.

Описанный выше механизм индукции, при котором один индуктор вызывает синтез нескольких ферментов одного метаболического пути, называют координиро­ванной индукцией. Наряду с ней в клетках микроорганизмов действуют системы по­следовательной индукции. При этом длина цепочки индуцируется своим собственным субстратом (субстратом для первого фермента в цепочке).

Репрессия синтеза ферментов - это процесс, осуществляющийся по принципу об­ратной связи. Это означает, что конечный продукт цепи биохимических реакций по­давляет синтез действия фермента, катализирующего первую реакцию цепи. Подоб­ный механизм обеспечивает равновесие между скоростями синтеза низкомолеку­лярных соединений и их расходования на построение биополимеров и исключает непродуктивные затраты веществ и энергии на образование излишних количеств промежуточных продуктов.

Репрессия - подавление синтеза ферментов осуществляется следующим обра­зом. Регуляторный ген R кодирует синтез белка-репрессора (анорепрессора), кото­рый в свободном состоянии неактивен, но может быть активирован корепрессором, который и является конечным продуктом цепи биохимических превращений.

Активированный белок-репрессор связывается с геном-оператором О, что препятствует считыванию информации со структурного гена R и, следовательно, синтезу соответствующего фермента. В отсутствие корепрессора синтез фермента происходит беспрепятственно.

Если мы добавим в питательную среду какой-либо индуктор целевого вещества (Слайд 25), то происходит сверхсинтез этого вещества, в количествах, многократно превышающих потребности самой клетки. Это явление широко используется на практике при производстве биологически ак­тивных веществ (аминокислот, витаминов, ферментов)