Оценку точности проводили на трех концентрациях, лежащих в диапазоне нормируемого количества белка в препарате: 0,020-0,100 мг/мл..
В мерные пробирки вместимостью 10 мл помещали навески СО Лактоферрин содержащего 0,02-0,100 мг белка, растворяли в 1 мл раствора. Рассчитывали содержание белка в модельных пробах (мг).
В каждую пробирку добавляли по 5 мл реактива Фолина. Тщательно перемешивали и оставляли на 10 мин в темноте при комнатной температуре. Затем добавляли 0,5 мл реактива Фолина и оставляли пробы на 30 мин в темноте при комнатной температуре.
Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Между измерениями кюветы промывали 50 % раствором этанола в воде.
В качестве раствора сравнения использовали контрольный раствор, не содержащий препарата.
С помощью калибровочонго графика стандартного раствора БСА (400 мкг/мл) определяли содержание белка в каждой модельной пробе – (Мн), мкг.
Определяли открываемость R (%) содержания белка по формуле:
R= (Mн×100)/Mв,
где Mв и Mн – истинное (взятое) и экспериментально найденное значения содержания белка в модельной пробе.
Результаты.
Полученные результаты представлены в таблице 2.
Зависимость между взятым Мв и найденным Mн количеством белка в модельных пробах в диапазоне нормируемого количества белка в препарате 0,020-0,100 мг/мл., определенная методом наименьших квадратов, представлена на рис. 2 и выражается следующим линейным регрессионным уравнением:
Мн = 0,9913*Мв + 0,46
r =0,9994; S = 32,7724; n = 9,
где r - коэффициент корреляции, S – стандартное отклонение.
Низкое значение свободного члена уравнения 0.46 мкг по сравнению с навеской СО Лактоферрин подтверждает высокую точность методики, а высокий коэффициент корреляции r = 0,9994 – хорошую линейность.
Протокол № 5 (продолжение)
Таблица.
Результаты определения открываемости содержания белка в модельных пробах СО Лактоферрин,
№ | Количество СО в 1 мл модельной пробы, мг | Содержание белка в модельной смеси | Оптическая плотность D | Открываемость R= (Mн·100)/Mв, % | |
Взято Mв, мкг | Найдено Mн, мкг (по калибровочой прямой) | ||||
0,104 | 101,0 | 99,9 | 0,186 | 98,91 | |
0,107 | 104,0 | 102,0 | 0,192 | 98,1 | |
0,103 | 99,0 | 100,9 | 0,180 | 101,870 | |
0,057 | 55,0 | 55,7 | 0,115 | 101,30 | |
0,053 | 51,0 | 50,5 | 0,110 | 99,04 | |
0,058 | 56,0 | 55,9 | 0,118 | 99,88 | |
0,025 | 24,0 | 24,4 | 0,067 | 101,65 | |
0,027 | 26,0 | 26,6 | 0,070 | 102,12 | |
0,029 | 28,0 | 27,5 | 0,074 | 98,24 | |
Средний результат | 100,123 | ||||
Стандартное отклонение | 1,624 | ||||
Критерий Стьюдента | 2,31 | ||||
Средневзвешенная дисперсия | 2,637 | ||||
Относительное стандартное отклонение RSD | 1,624 |
Рис. 2. Зависимость между взятым и найденным количеством белка в модельных пробах
СО Лактоферрин.
Отклонения/ примечания: нет
Заключение: подтвержден показатель точности (правильность) методики определения содержания белка (количественное определение). Открываемость с доверительной вероятностью 95 % составляет 98,1 ¸ 102,1 % то есть практически не выходит за пределы критерия приемлемости 98,0 - 102,0% (точка 8, для которой найденное значение открываемости составило 102,1 % находится на нижнем пределе диапазона чувствительности данной методики, поэтому полученное отклонение 102,1 % можно считать несущественным).
Выполнил _________ ____________ ________ ___________________
(дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)
Проверил _________ ____________ ________ ___________________
(дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)
ПРОТОКОЛ № 6
ОЦЕНКА МЕТОДИКИ НА ВНУТРИЛАБОРАТОРНУЮ ПОВТОРЯЕМОСТЬ (СХОДИМОСТЬ)
Повторяемость (один из показателей точности методики) – степень близости друг к другу независимых результатов, полученных в условиях повторяемости, а именно:
- одним и тем же методом
- на идентичных объектах испытаний (идентичных частях пробы)
- в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором
- с использованием одного и того же оборудования и средств измерений
- в короткий промежуток времени (в который не проводится перекалибровка оборудования) и сохраняются параметры окружающей среды.
Мерой рассеяния результатов в условиях повторяемости является относительное стандартное отклонение повторяемости (Sr).
Объект. Методика определения белка (количественное содержание) по методу Лоури в препарате Лапрот.
Описание теста. Определяется внутрилабораторная повторяемость (сходимость) результатов содержания белка в одной серии препарата Лапрот, выполненных одним аналитиком на одном спектрофототометре в течение одного дня.
Критерий приемлемости: Относительное стандартное отклонение повторяемости Sr ≤ 2,0 %