В промышленности для культивирования микроорганизмов могут применяться питательные среды различного состава. При этом с целью снижения затрат на производство продуктов стараются использовать питательные среды на основе сырья растительного происхождения и отходов различных отраслей промышленности. Из наиболее часто используемых источников следует отметить: гидролизаты растительной биомассы, отходы целлюлозно-бумажной и пищевой промышленности, отходы сельского хозяйства, а также продукты химической и нефтяной промышленности (спирты, органические кислоты, углеводороды).
Рецептура питательных сред. Основной принцип при составлении питательных сред – удовлетворение физиологических потребностей продуцента. Достигается это экспериментальным путём с использованием методов математического планирования эксперимента. Концентрация основного источника углерода определяется с учётом коэффициента его конверсии. Так, при соблюдении оптимальных условий культивирования коэффициенты конверсии в биомассу для метанола и глюкозы составляет 0,50, этанола – 0,70-0,75, гексадекана – 1,0-1,1, жидких парафинов – 1,2-1,3. Таким образом, для получения 30 г/л биомассы при периодическом культивировании необходимо – 60 г метанола и глюкозы, 40 г этанола, 30 г гексадекана, 24 г н -алканов. Концентрации метанола в среде более 1 %, этанола – более 1,5-2,0 % – токсичны для микроорганизмов. Глюкоза, фруктоза и другие низкомолекулярные сахара при концентрации выше 7-8 % тормозят рост большинства микроорганизмов. Потребность микроорганизмов в минеральном питании выясняют исходя из экспериментальных данных их культивирования с использованием синтетических питательных сред строго определённого состава и на основании состава золы биомассы. Количество азотсодержащих веществ, необходимых для конструктивного метаболизма определяют исходя из содержания азота в биомассе и её выхода, учитывая, что около 5 % азота не используется культурой.
Как правило потребность в минеральных элементах, необходимых для выращивания биомассы (30 г/л): сульфат аммония – 12; однозамещённый фосфат калия – 1,3; сульфат магния – 1,5; макроэлементы (железо, кальций и магний) – по 10-3; микроэлементы (медь, кобальт, цинк, молибден и марганец) – 10-4.
Углеводное сырьё. Гидролизаты растительной биомассы. Химический состав гидролизатов зависит от вида сырья. Основными компонентами растительного сырья являются полисахариды (40-75 %) и лигнин (15-60 %). Фитополисахариды представлены легко- и трудногидролизуемыми полисахаридами. К легкогидролизуемым полисахаридам, которые составляют 16-39 % относятся гемицеллюлозы и пектиновые вещества. Трудногидролизуемые полисахариды растений (25-50 %) представлены целлюлозой и незначительным количеством гемицеллюлоз.
Наибольшее количество редуцирующих веществ образуется при гидролизе кукурузной кочерыжки, а также древесины хвойных и лиственных пород деревьев (до 83 % и до 73 % соответственно). При производстве фурфурола, ксилита и ксилозы лучшим считается сырьё, содержащее большое количество пентоз, а при производстве спирта – предпочтительней древесина хвойных пород деревьев. Пентозы не усваиваются большинством дрожжей и не могут использоваться при производстве белка одноклеточных микроорганизмов на послеспиртовой барде. Сырьё, содержащее большое количество уроновых кислот, даёт гидролизаты более низкого качества. При гидролизе сырья, содержащего ацетильные группы, образуется свободная уксусная кислота, которая является балластом при производстве спирта, но усваивается дрожжами-продуцентами белка. Содержание метоксильных групп в растительном сырье составляет до 2-7 кг/т, что обусловливает необходимость очистки этилового спирта, образующегося при сбраживании гидролизатов. Кроме того, аминокислоты, образующиеся при гидролизе растительного сырья, при спиртовом брожении образуют сивушные масла, а при производстве ксилита и ксилозы для устранения ингибирующего влияния аминокислот перед гидролизом растительной биомассы из неё удаляют белки.
Основной способ гидролиза растительного сырья – перколяционный гидролиз разбавленным раствором серной кислоты при повышенном давлении и температуре (0,3 МПа и 180-190 ºС) в гидролиз-аппаратах. Вода, для разбавления серной кислоты сначала подогревается в теплообменниках низкого давления до 50-60 ºС, а затем из сборника центробежным насосом под давлением 0,4-0,5 МПа подаётся в теплообменник где подогревается до 120-140 ºС и под давлением 1 МПа направляется в подогреватель, где нагревается глухим паром до 160-170 ºС, а затем острым паром в струйном подогревателе. Гидролизат отводится в систему испарителей (3 последовательные стадии), где происходит ступенчатое охлаждение и снижение давления (температура снижается до 100-105 ºС). В первом испарителе гидролизат охлаждается до температуры 140-150 ºС, во втором – до 115-125 ºС, в третьем – до 100-105 ºС. Пары самоиспарения, которые составляют до 10 % от объёма гидролизата, отводятся вместе с фурфуролом. Конденсат направляется в испаритель конденсата, где охлаждается до 100 ºС и направляется в сборник конденсата и затем на производство фурфурола.
рН растворов гидролизатов составляет 1,3-1,4, а в его состав входят (%):
-редуцирующие вещества – 2,5-3,5;
-органические кислоты – 0,2-0,4;
-серная кислота – 0,5-0,7;
-уроновые кислоты – 0,1-0,2;
-фурфурол – 0,03-0,09;
-оксиметилфурфурол – 0,08-0,2;
-формальдегид – 0,005-0,015;
-взвешенные частицы (лигнин и гуминовые кислоты) – 0,2-0,4.
Доброкачественность гидролизатов определяется веществами (фурфурол, оксиметилфурфурол и лигногуминовые вещества), которые способны ингибировать рост микроорганизмов (выход биомассы в единицу времени). Концентрация этих соединений не должна превышать 0,03-0,04 %, 0,05-0,1 % и 0,1 % соответственно.
Гидролизаты из последнего испарителя направляются в инвертор, где температура их снижается до 98-99 ºС за счёт паров самоиспарения. Инверсия проходит в течение 2-3 ч. За это время гидролизаты дополнительно освобождаются от взвешенного в них лигнина и смол. После инверсии следуют стадии нейтрализации, отделения осадка, охлаждения до 30-35 ºС и удаления из гидролизатов летучих примесей. Оставшийся на дне гидролиз-аппарата лигнин через быстрооткрывающийся клапан выстреливается в циклон, где отделяется от паров самоиспарения и охлаждается до 105-110 ºС.
Гидролизаты торфа. Используется верховой торф со степенью разложения не более 20 %. В состав гидролизатов торфа входят (%): легкогидролизуемые полисахариды – 25-32; целлюлоза – 10-13; уроновые кислоты – 10-17; уксусная кислота – 0,4-0,5; формальдегид – 0,8-1,2.
Для гидролиза торфа предложены методы, отличающиеся от перколяции. Это связано с низким содержание в торфе целлюлозы и его большим гидравлическим сопротивлением. В основе предложенных методов – периодический способ гидролиза торфа 0,3-0,5 %-ным раствором серной кислоты при повышенном давлении 0,6-0,8 МПА при 160-170 ºС или концентрированным раствором серной кислоты при атмосферном давлении. При мягком гидролизе уроновые кислоты декарбоксилируются, превращаясь в пентозы.
Отходы целлюлозно-бумажной промышленности (предгидролизаты и сульфитные щелока). Предгидролизаты. Они образуются при первичной обработке древесной щепы горячей водой. Уксусная кислота которая выделяется при этом из сырья подкисляет воду до рН – 4,5, что приводит к частичному гидролизу гемицеллюлоз. Выход предгизролизатов из 1 т древесины составляет 6 м3. Предгидролизаты обрабатывают разбавленной серной кислотой для инверсии. Эти стадии аналогичны соответствующим стадиям получения гидролизатов.
Сульфитные щелока. Выход сульфитных щелоков составляет 6,5-8 м3 на 1 т используемого сырья. Древесину обрабатывают при повышенной температуре и давлении водным раствором сернистой кислоты, что приводит к гидролизу легкогидролизуемых гемицеллюлоз, а лигнин при этом превращается в водорастворимый коллоид. Применяют следующие виды обработки древесины:
-монобисульфитную варку при рН 6,0-7,0 с помощью сульфита кальция;
-бисульфитную варку при рН 4,0-4,2 с помощью гидросульфита кальция;
-кислую бисульфитную варку при рН 1,0-1,5 с помощью гидросульфита кальция и диоксида серы.
Для культивирования микроорганизмов (дрожжей) используются сульфитные щелока, полученные с помощью бисульфитной и кислой бисульфитной варок. В состав щёлоков входят (%): редуцирующие вещества – 1,7-3,1; органические кислоты – 0,2-0,5; сернистая кислота – 0,06-0,1; формальдегид – 0,03-0,06; фурфурол – 0,02-0,06; гидросульфит кальция – до 0,8. рН растворов щелоков, получаемых при использовании бисульфитной и кислой бисульфитной варок составляет 1,5-2,0 ил 3,5-4,2.
После обработки древесины следуют стадии инверсии, отделения волокон целлюлозы с помощью вакуум-фильтрации, десульфитации растворов острым паром и воздухом, а также нейтрализации растворов. Для нормального роста микроорганизмов содержание диоксида серы в щелоках не должно превышать 0,005 %, а волокон целлюлозы – 0,05 г/л.
Меласса. Имеет плотность – 1,35-1,40 г/см3 и рН – 7,2-8,9. В её состав входят (%): «сухие» вещества – 61-86; сахароза – 40-55; инвертный сахар – 0,5-2; раффиноза – 0,5-2,5; общий азот – 1,1-1,5 (1/3 в форме бетаина). Меласса содержит свободные аминокислоты (аспарагиновую, глутамин, лейцин, изолейцин и тирозин), а также витамины (тиамин, рибофлавин, никотиновую и пантотеновую кислоты). В большинстве меласс высокое содержание биотина (в свекловичной – 40-130 мг/т, в тростниковой – 2,7-3,2 г/т). Зола составляет 6-10 %. В её составе много калия (до 30-40 % золы), магния (до 1,5-4,5 %) и кальция (до 14 %). Меласса также содержит молочную и муравьиную кислоты 0,2-0,5 %.
Кукурузный экстракт. Его получают при обработке кукурузного зерна в крахмало-паточном производстве. Кукурузный экстракт представляет собой упаренные до содержания «сухих» веществ 48-50 % замочные воды. Исходное содержание «сухих» веществ в замочной воде – 8 %. Кукурузный экстракт не имеет постоянного состава. Содержит большое количество меланоидинов (производные тирозина и полифенолов), которые придают концентрату тёмно-коричневый цвет. Содержание в кукурузном экстракте азотистых веществ от общего количества «сухих» веществ составляет – до 40-50 %. Под действием молочнокислых бактерий часть углеводов экстракта сбраживается до молочной кислоты, что обусловливает её высокое содержание.
Состав кукурузного экстракта (%): общий азот – 2,7-4,5; аминный азот – 1,0-2,0; редуцирующие сахара – 0,1-11,0; молочная кислота 5-11,5; летучие кислоты – 0,1-0,5; диоксид серы – 0,01-0,02 (не более 0,5). Зола содержит калий (0,5-1,0 %), фосфор и кальций (0,25-0,75 %), медь (менее 0,001 %); цинк (0,003-0,005 %), железо (0,01-0,03 %); магний (0,25-0,50 %) и серу (0,15-0,20 %). Кукурузный экстракт содержит аминокислоты (г/кг «сухих» веществ): глицин – 18,17; аланин – 24,70; валин – 19,64; лейцин – 35,38; изолецин – 6,57; серин – 17,65; треонин –14,05; аспарагин – 26,88; глутамин – 64,95; лизин – 16,72; аргинин – 14,81; цистин – 0,26; метионин – 6,60; фенилаланин – 12,77; пролин – 33,08; тирозин – 8,28; гистидин – 14,36. Он является источником витаминов группы В, особенно биотина (150-200 мкг/100 г). Кукурузный экстракт часто инфицирован микрофлорой. Применяется при производстве аминокислот, ферментов, энтомопатогенных препаратов, бактериальных удобрений и др.
Гидрол. Это отход производства глюкозы из крахмала. Представляет собой густой сироп тёмного цвета с рН – 4,0. Гидрол содержит 50 % углеводов, которые представлены главным образом глюкозой (до 80 %). Гидрол нестандартен по составу. Содержание в нём редуцирующих веществ – 67-72%. Он также содержит около 18 % несбраживаемых сахаров и органических кислот. Зольность гидрола составляет не более 7 %. В состав золы входят соли, содержащие фосфор, магний, натрий и железо.
Мелассная и зерно-картофельная барда. Это отходы спиртового и ацетоно-бутилового производств с содержанием «сухих» веществ – 6-12 %. Состав их зависит от качества сырья, способа его переработки и изменяется в широких пределах.
Спиртовая барда в составе «сухих» веществ содержит (%): белок – 11,0-12,0; несброженные сахара (глюкозу, фруктозу, арабинозу и раффинозу) – 4,0-7,0; глицерин – 7,0-9,0; органические кислоты (молочную, уксусную, пропионовую и гликолевую) – 13,0-20,0; бетаин – 8,0-10,0; глутамат – 6,0-9,0; другие аминокислоты (лейцин, аргинин, фенилаланин, серин, аспарагин, валин, глицин, тирозин и g -аминомасляная) – 1,0-3,0; жиры – 10,0-15,0. В её состав также входят гумины, меланоидины, гликозиды и фенолы. Общее количество органических веществ от содержания «сухих» веществ – 68-72 %. Количество неорганических веществ в составе «сухих» веществ (%): калий – 12,0-15,0 (в пересчёте на оксид калия); азот) – 2,5-3,5 (в пересчёте на оксись азота); кальций – 0,2-1,3 (в пересчёте на оксид кальция); фосфор – 0,2-0,3 (в пересчёте на оксид фосфора). Другие неорганические соединения, содержащие магний, медь, кобальт, железо и цинк – 10,5-11,9 %.
Спиртовая барда содержит витамины группы В (рибофлавин – до 8,0 мг/г; пантотеновая кислота – до 39,0; никотиновая кислота – до 0,3). Кроме того, в её состав входят спирты (этиловый, изоамиловый и др.). Значения рН растворов спиртовой мелассной барды составляют 4,2-5,6.
Ацетоно-бутиловая барда. Состав ацетоно-бутиловой бардынезначительно отличается. Содержание «сухих» веществ в ней – 2,81-4,45 %, в том числе нерастворимых – 1,05-1,30 %. В барде содержится 0,62-0,96 % углеводов (в пересчёте на глюкозу), 0,78-1,00 % азотсодержащих веществ (в том числе растворимых – 0,70-0,96 %), 0,08-0,28 % клетчатки, 0,1-0,14 % зольных веществ, а также 0,12-0,47 % других экстрактивных веществ и жиров. Остаточное содержание бутанола в барде – 0,07-0,30 г/л.
Спиртовую и ацетоно-бутиловая барды используют для производства антибиотиков, витаминов, кормовых дрожжей и т.д.
Молочная сыворотка. Это отход производства сыра, казеина и творога в молочной промышленности. Из сыворотки удаляют белки нагревая её до 85 °С в течение 10 мин (или снижают рН до 2,0-3,0).
В сыворотку переходит до 50 % «сухих» веществ молока. Состав её варьирует от сырья, способа отделения (сквашивание, использование органических или неорганических кислоты, или ферментов). Состав (%): «сухие» вещества – 5,3-6,5; белок – 0,5-1,0; жир – 0,05-0,4; лактоза – 4,0-4,8; зола – 0,5-0,7. Основной источник углерода в сыворотке – лактоза. В небольшом количестве содержатся также глюкоза, галактоза, арабиноза и полисахариды. Азотистые вещества представлены белками и органическими соединениями. Основной белок сыворотки – казеин. Небелковые азотистые вещества составляют 25-30 % от азотсодержащих веществ. Кроме того, сыворотка содержит: аминокислоты (до 2,9 мг/100 г); мочевину (до 3,5 мг/100 г); мочевую кислоту (до 11,3 мг/100 г); пурины (до мг/100 г). В её состав входят молочная, уксусная, пропионовая, муравьиная и лимонная кислоты. Причём содержание молочной кислоты составляет – 0,5-0,8 %. В сыворотке в небольшом количестве содержатся и минеральные кислоты (хлористоводородная и серная), которые применяются при производстве пищевого и технического казеина. Минеральные вещества (0,6-0,7 %) представлены в основном солями калия, натрия, магния и кальция (всего 30 макро- и микроэлементов). В состав золы входят (%): калий, в пересчёте на оксид калия – 30,3; натрий, в пересчёте на оксид натрия – 3,2; кальций, в пересчёте на оксид кальция – 20,1; магний, в пересчёте на оксид магния – 2,4; фосфор, в пересчёте на оксид фосфора – 22,4; сера, в пересчёте на диоксид серы – 2,6, хлор – 14,0.
Основную часть водорастворимых витаминов молока составляют тиамин (0,35-0,45 мкг/мл), аскорбиновая (4,7 мкг/мл) и никотиновая (1,05-1,76 мкг/мл) кислоты. Кроме того, в его состав входят токоферол (0,20-0,29 мкг/мл), филлохинон (0,4 мкг/мл), рибофлавин (1,8-2,5 мкг/мл), пиридоксин (1,2-1,5 мкг/мл), кобаламин (0,1-2,9 мкг/мл), биотин (0,01-0,04 мкг/мл), холин (165-400 мкг/мл), пантотеновая кислота (2,9-4,4 мкг/мл), п -аминобензальдегид (0,1 мкг/мл) и фолиевая кислота (0,19-0,80 мкг/мл).
Молочную сыворотку используют для производства молочной кислоты, дрожжей и спирта. Однако большая её часть (до 88 %) идет на кормление животных.
Кукурузная мука. 67-70 % кукурузной муки составляет крахмал и 10 % других углеводов (целлюлоза, пентозаны, декстрины и растворимые углеводы). Белки составляют – до 12 %, жир – до 4 %, зола – до 0,92 %. В состав золы входит фосфор, в пересчёте на оксид фосфора – до 45 %, калий, в пересчёте на оксид калия – до 30 %, магний, в пересчёте на оксид магния – до 15 %. Влажность не более 15 %. Кукурузная мука является самой дешёвой из всех зерновых. Используется в составе питательных сред при микробиологическом синтезе ферментов, антибиотиков, энтомопатогенных препаратов, бактериальных удобрений и т.д.
Соевая мука. Используется мука трёх сортов: обезжиренная; полуобезжиренная; необезжиренная. Может быть дезодорированная (пропаренная) и не дезодорированная. Срок хранения пропаренной муки – 1 год, не пропаренной – 2-3 мес. Содержание влаги – 9-10 %. Наиболее ценный компонент белки и пептиды – главным образом глицинин. В белке содержится до 20 % глутаминовой кислоты. Количество углеводов в соевой муке не более 25 %. При этом, содержание крахмала и глюкозы – не более 1 %, а сахарозы – 5-10 %. Соевая мука содержит также пентозаны, мальтозу, раффинозу, гемицеллюлозы и декстрины. Содержание золы в ней – до 4,4-6,5 %. Она также содержит лецитин, который придает ей эмульгирующие свойства и витамины группы В, Д и А.
Крахмал картофельный и кукурузный. По содержанию зольных элементов (от 0,35 до 1,20 %) различают крахмал 4-х сортов (высший, 1, 2 и 3). Состав (%): крахмал – 98,5-98,8; белок – 0,35; жир – 0,62-0,70; зола – 0,12-0,17; растворимые вещества – 0,01-0,05.
Пшеничные отруби. Содержат от 16 до 20 % крахмала, 10-12 % белка и свободные аминокислоты в том числе метионин – 0,19 %; цистеин – 0,30 %; аргинин – 1,0 %; лизин – 0,6 %; триптофан – 0,3 %. В состав пшеничных отрубей входят жир – 3-4 %, клетчатка – 10-30 % и зола, которая содержит макро- (Na – 0,09 %, К – 1 %; Са – 0,16 %; Р – 0,94 %) и микроэлементы.
Солодовые ростки. Содержат в большом количестве (до 24 %) свободных аминокислот и азотистые вещества. Зола составляет – 8 %, клетчатка – 14 %, экстрактивные безазотистые вещества – 42 %, зерновые примеси – 5-6 %. Они содержат витамины группы В, в том числе и биотин (до 128 мкг/кг «сухого» вещества ростков). Солодовые ростки используют также в виде экстрактов, которые получают обработкой при гидромодуле 1:10 при 50 °С. Экстракты упаривают до содержания «сухих» веществ 50 % (исходное – около 4 %).
Пивная дробина. Выход её составляет 22 % от массы сухого сырья (солод), поступающего в варочное отделение. Используют или во влажном (83 % влаги) или в сухом состоянии. Она содержит 26-27 % белка, 7-8 % жира; 17-18 % клетчатки, около 44 % безазотистых экстрактивных веществ и 4-5 % золы.
Свекловичный жом. Содержит безазотистые экстрактивные вещества – 66 % (пектин и гемицеллюлозы), клетчатку – 22 %, белок – 8 %, золу – 4 %.
Измельчённый картофель или отвар из него. Содержит крахмал – 8-27 %, азотистые экстрактивные вещества – 20 %, клетчатку – 1-1,5 %. Зола (0,8-1,0 %) содержит макро- и микроэлементы (К, Na, Mg, Ca, Fe, Si, Mn, Co, Cu, Ni, I и т.д).
Этанол. Получают гидратацией этилена (прямая и сернокислотная), используют также гидролизный спирт и пищевой этанол. Спирт применяют для производства пищевого уксуса, а также он использовался для получения белка одноклеточных микроорганизмов.
Метанол. Получают из синтез-газа. Использовался для получения белка одноклеточных микроорганизмов.
Уксусная кислота. Получают химическим синтезом из этилена (окисление) или карбонилированием метанола. Концентрация получаемой уксусной кислоты не менее 60 %. Она содержит формальдегид и муравьиную кислоту (не более 1 %), а также нелетучий осадок (не более 0,1 %). Используется производства аминокислот, а также применялась для получения белка одноклеточных микроорганизмов.
Жидкие углеводороды. Использовались для получения белка одноклеточных микроорганизмов (кормовых дрожжей). Для этой цели применяли дизельную фракцию нефти, содержащую не менее 15 % н -парафинов, или очищенные углеводороды. В зависимости от происхождения соотношение основных классов органических соединений в нефти колеблется. Наиболее распространена нефть следующего состава: 50-60 % нафтенов; 20-30 % углеводородов с открытой цепью; 15-30 % ароматических соединений; 0,1 % воды и 3-4 мг/л хлоридов.
Дизельная фракция с температурой перегонки 200-360 ºС содержится в нефти в количестве 17-21 %. Бензин составляет 12-18 %, керосин – 16-18 %, вакуумные дистилляты – 22-23 %, гудрон – 30 %, а газ – 1,0-1,2 %.
При содержании в дизельной фракции не менее 15 % н -алканов её непосредственно использовали для культивирования микроорганизмов. При меньшем содержании н -алканов их предварительно выделяли из нефти карбамидной депарафинизацией или адсорбционным извлечением с помощью цеолитов. В первом случае получали парафины, содержащие до 85-92 % н -алканов и до 5 % ароматических соединений. Их дополнительно очищаюли концентрированной серной кислотой. В результате очистки содержание ароматических углеводородов снижалось до 0,2-0,4 %. Во втором случае, содержание н- алканов составляло не менее 98 %, а ароматических углеводородов и серы не более 0,2 % и 0,05 % соответственно.
Метан. Является основным компонентом природного газа (до 100 %). Для культивирования бактерий-продуцентов белка его предварительно очищали от серусодержащих соединений, ингибирующих рост клеток. Очистку от меркаптанов, сероводорода и воды осуществляли с помощью моноэтаноламина. Очищенный природный газ имел следующий состав (%, по объёму): метан – не менее 95; этан – не более 2; пропан – не более 1; другие гомологи метана – не более 1; диоксид углерода – не более 1; сероводород – не более 0,01; серосодержащие органические соединения – 0,001.