Несмотря на разнообразие микроорганизмов-продуцентов, а также синтезируемых ими метаболитов можно выделить общие для любого биотехнологического производства стадии: подготовки сырья и биологически действующего начала (предферментационная стадия); ферментации (на ней происходит синтез целевого продукта, эта стадия определяет предферментационные процедуры и следующие за ней стадии); выделения целевого продукта из культуры продуцента и его очистки; приготовления товарных форм продукта. Начальные стадии в инженерной энзимологии состоят из приготовления субстрата с заданными свойствами (рН, концентрация и температура) и подготовки ферментного препарата.
Подготовка сырья. Потребность культур микроорганизмов в тех или иных веществах определяется их физиологическими особенностями, но во всех случаях питательная среда представляет собой водный раствор этих веществ. Основу питательной среды для культивирования микроорганизмов составляет источник углерода – субстрат. Это могут быть высокомолекулярные соединения (белки, полисахариды) или низкомолекулярные (даже такие простые как метан и диоксид углерода). Кроме источников углерода питательная среда должна содержать макро- и микроэлементы, ростовые факторы (для ауксотрофов), которые вводятся в состав сред в виде солей, автолизатов, гидролизатов или экстрактов. Питательные среды готовят в аппарата-смесителях, куда подают отдельные компоненты сред в последовательности, установленной регламентом. Жидкие и твёрдые источники углерода вводят в уже приготовленную питательную среду, непосредственно перед ферментацией.
Важный элемент при подготовке питательных сред – требования асептики. В зависимости от жёсткости условий или ограничиваются созданием определённой рН, или проводят стерилизацию подаваемой в ферментатор среды. Самый распространённый метод стерилизации питательных сред –термическая стерилизация при 120-150 °С. Её осуществляют в периодическом или непрерывном режимах. При непрерывном способе используют установки непрерывной стерилизации, состоящие из нагревателя, выдерживателя и теплообменника. Используют контактные нагреватели (острый пар) или теплообменные аппараты (трубчатые, пластинчатые и спиральные). Термолабильные компоненты питательных сред стерилизуют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Сыпучие питательные среды стерилизуют острым паром или ИК-излучением. Для стерилизации газовых потоков используют волокнистые фильтры, заполненные базальтовыми или полимерными (полиакрилатными или полифторстирольными) волокнами диаметром 16-22 мкм.
Подготовка биологически-действующего начала. Эта стадия заключается
в сохранении и усилении продуктивных свойств штамма-продуцента (скорости роста, биосинтеза метаболитов), а также в снабжении основной ферментации посевным материалом.
Подготовка биологически-действующего начала. Эта стадия заключается
в сохранении и усилении продуктивных свойств штамма-продуцента (скорости роста, биосинтеза метаболитов), а также в снабжении основной ферментации посевным материалом.
В настоящее время в промышленности используются немногим более 100 видов микроорганизмов. Это связано с тем, что промышленные штаммы должны отвечать следующим требованиям: способность синтезировать целевой метаболит при минимальном образовании побочных продуктов; способность расти на дешёвых субстратах (возобновляемое сырье или отходы); высокий экономический коэффициент; высокая скорость роста, т.к. синтез большого количества метаболитов протекает синхронно с ростом клеток продуцента; генетическая однородность и стабильность свойств штамма по продуктивности и требованиям к условиям культивирования; устойчивость к фагам и посторонней микрофлоре; безвредность; термофильность, ацидофильность или алкалофильность.
Природные штаммы не обладают такими свойствами, поэтому для получения промышленных продуцентов используют методы генетического конструирования (селекции). Различают генетическое конструирование in vivo и in vitro. Генетическое конструирование in vivo базируется на процессах, протекающих в природе (мутагенез, гибридизация, конъюгация; трансформация, трансдукция и транспозиция) и направлено на получение регуляторных и прототрофных мутантов. В основе генетического конструирование in vitro лежит использование методов генетической инженерии (манипуляции с выделенными из клеток молекулами ДНК).
Наибольшее распространение получили методы мутагенеза (естественного и индуцированного). С их помощью например были созданы промышленные продуценты пенициллина Penicillium chrysogenum, которые способны накапливать до 20-25 г/л пенициллина G в культуральной жидкости (продуктивность дикого штамма составляла 5-20 г/л; был использован 21 цикл мутагенеза с применением УФ- и рентгеновского излучения, этиленимина и т.д.). С помощью мутагенеза были получены продуценты стрептомицина Streptomyces griseus, накапливающие до 2000 ед./мл антибиотика (продуктивность «диких» штаммов – 250 ед./мл) и лимонной кислоты Aspergillus niger, которые синтезируют до 98 % лимонной кислоты от потреблённого субстрата.
Хранение. Культуры микроорганизмов в производственных условиях поддерживают следующими основными способами: субкультивированием (в том числе и хранением под слоем минерального масла); в условиях низких температур; в высушенном (в том числе и лиофильно) состоянии.
Субкультивирование – периодические пересевы в пробирках со скошенной агаризованной питательной средой. Используют для хранения микроорганизмов, которые не выдерживают замораживания или высушивания. Пересев аспорогенных бактериальных культур на свежие питательные среды проводят 1-2 раза в месяц (иногда еженедельно). Спорогенные бактерии, а также дрожжи и мицелиальные грибы пересевают через 2-3 месяца. Частые пересевы, особенно на жидкие питательные среды, вызывают изменение свойств культуры. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте, при температуре от 4 до 20 °С. Культуру переносят на хранение в конце экспоненциальной фазы или в начале стационарной фазы роста. К преимуществам данного метода относится возможность визуального контроля за однородностью и морфологическими свойствами (наличие R и S вариантов, секторные колонии, апигментация и т.д.) продуцентов. Методом субкультивирования большинство бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов, а также водоросли и простейшие. В то же время, молочнокислые бактерии при субкультивировании утрачивают свои свойства.
Способ хранения микроорганизмов под слоем минерального масла является разновидностью субкультивирования. Он отличается простотой, т.к. не требует специальной аппаратуры и обеспечивает относительно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности признаков большинства микроорганизмов. Культуры микроорганизмов, выращенные на полноценных питательных средах, заливают стерильным вазелиновым маслом (высота слоя масла над поверхностью среды – 0,5-1,0 см). Это замедляет скорость обменных процессов и предохраняет культуру от высыхания. Аэробные культуры выращивают в пробирках на поверхности короткоскошенного агара (45°; 4-5 мл среды). Анаэробные культуры бактерий (пропионовокислые) – высевают уколом в слой среды, а молочнокислые бактерии выращивают в полужидкой среде (0,25-0,40 %-ный агар) и затем заливают стерильным вазелиновым маслом. Аспорогенные бактерии заливают маслом в начале стационарной фазы роста, спорогенные – в стадии спорообразования, актиномицеты и мицелиальные грибы – 7-14 суточные культуры, а дрожжи – 12-14 суточные культуры.
Метод хранения в высушенном состоянии заключается в снижении содержания влаги в клетках до 10-12% (из них 2-5% – «связанная» вода). Процесс высушивания лучше всего переносят спорогенные культуры, особенно бактерии. Культуры микроорганизмов высушивают на воздухе при комнатной температуре. В качестве адсорбентов используют стерильные: почву, песок, глину, силикагель, фильтровальную бумагу, нерастворимые фосфаты, мел и т.д. Высушенные микроорганизмы хранят в темноте при комнатной температуре. Реактивация заключается в увлажнении культур и пересеве их на полноценные по составу питательные среды.
L-высушивание – высушивание при комнатной температуре из жидкого состояния под вакуумом.
Метод лиофилизации основан на высушивании клеток из замороженного состояния под вакуумом, минуя жидкую фазу. Выживаемость клеток при лиофилизации зависит от чувствительности микроорганизмов, стадии роста культуры, концентрации клеток, состава защитных сред, режима лиофилизации, условий реактивации, ионной силы раствора, а также условий и продолжительности хранения. Для лиофилизации используют концентрированную суспензию клеток (109 -1010 клеток/мл) в защитной среде, которую разливают по 0,2 мл в ампулы, охлаждают до -25…-45 °С и высушивают под вакуумом (0,11-0,17 мм. рт. ст.) в течение 5-6 ч. Ампулы запаивают под вакуумом и хранят культуры в темноте при 4 °С. Оптимальная остаточная влажность – 2-6 % (высушивание ниже 0,5-1,5 % губительно для культуры).
Культуру для лиофилизации отбирают в конце экспоненциальной фазы роста. Реактивация заключается в добавлении к клеткам стерильной воды – 0,2-1 мл. Иногда используют мясной бульон, обезжиренное молоко, пептон, растворы органических кислот и полноценные по составу питательные среды. Восстановление свойств культуры происходит после несколько пассажей на полноценных по составу питательных средах.
В лиофильно высушенном состоянии часто хранят культуры продуцентов антибиотиков, органических кислот, ферментов, бактериальных препаратов, а также вакцины. Активность сохраняется в течение нескольких лет. Молочнокислые бактерии хранятся без потерь активности до 10 лет.
В качестве криопротекторов используют сложные смеси: сыворотку крови, белки сыворотки, желатину, обезжиренное молоко, мясной бульон, декстрин, крахмал, полиэтиленгликоль и пептон. Кроме того, применяют простые соединения: глюкозу, сахарозу, а также растворы, содержащие смесь сахарозы (до 10 %) и желатины (до 1 %). Криопротекторы обеспечивают быстрое замораживание и предохраняют от разрывов клеточные стенки, сохраняют остаточную влагу.
Хранение при температуре жидкого азота (196 °С). Преимущество данного метода заключается в малой вероятности заражения, а также стабильном сохранении культурой свойств, небольшом количестве затрачиваемого времени и материалов. К недостаткам относятся необходимость специального оборудования и нежелательность многократных замораживаний-оттаиваний. Этот метод позволяет хранить микроорганизмы от нескольких месяцев до нескольких лет. Для защиты культуры от повреждения при замораживании также применяют вещества-криопротекторы.
Приготовление посевного материала. Стабильность физиологических и морфологических признаков хранящихся штаммов микроорганизмов определяют в ходе контрольных высевов и маломасштабных ферментаций (пробирки, колбы, лабораторные ферментаторы).
По мере необходимости, из отделения чистой культуры в основное производство поступает заданное количество инокулята. При периодическом процессе культивирования (производство метаболитов) в отделении чистой культуры готовят посевные дозы для каждой из операций основного производства. При непрерывной ферментации в принципе не требуется подача биомассы с входящим потоком свежей среды. Однако на практике для повышения качества продукта время от времени или постоянно вводят небольшие дозы посевного материала штамма-продуцента. Всё это приводит к необходимости иметь в отделении чистой культуры ферментационную часть.
Процесс приготовления инокулята проходит в несколько этапов и заключается в пересевах микроорганизмов на возрастающие объёмы питательной среды: исходная культура ® скошенная агаризованная питательная среда (пробирки) ® выращивание на жидкой питательной среде (качалочные колбы или термостат). Эти стадии проходят в условиях лаборатории. В дальнейшем процесс продолжают в производственных условиях, обычно в две стадии: культивирование в ферментаторах небольшого объёма (инокуляторах) и в посевных аппаратах.
Подготовка посевного материала глубинным способом. Процесс приготовления инокулята начинается с культивирования штаммов микроорганизмов на скошенных агаризованных средах в пробирках в течение 12-24 ч (бактерии и дрожжи) и 72-120 ч (до начала обильного спорообразования) – грибы. С пробирок культуру (клетки или споры) смывают стерильной водой и переносят 1-5 % суспензии (по объёму) в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Выращивание культуры на этой стадии проводят на качалках при температуре 26-39 °С в течение 12-36 ч. Контроль культуры осуществляют по морфологическим показателям. Готовую культуру (объём – до 0,1 %) стерильно переносят в инокулятор, заполненный стерильной питательной средой. Коэффициент заполнения инокулятора 0,5-0,6 (исключение пеногасителя). Время культивирования – 1-4 сут. Затем культуру подают в посевной ферментатор. Отношение объёма инокулятора и посевного ферментатора, а также посевного и рабочего ферментатора составляет – 1: 10. Время выращивания культуры в посевном ферментаторе – 24 ч. Три раза в сутки отбирают образцы на микробиологический и биохимический анализ. Посевной материал готовят из расчёта 5-20 % от объёма питательной среды, используемой в основной ферментации. Иногда в целях сокращения пересевов и для сохранения чистоты культуры используют засев посевных ферментаторов непосредственно из колб. Объём инокуляторов и посевных ферментаторов составляет от 0,1 до 10 м3. Они снабжены мешалками (или барботёрами), контрольно-измерительной аппаратурой (рН, уровень пены), теплообменными устройствами.
Подготовка посевного материала поверхностным способом. Применяется для выращивания мицеллиальных грибов. Посевным материалом в этом случае является водная суспензия спор продуцента. В качестве твёрдой питательной среды используют увлажнённые пшеничные отруби с влажностью 45-56 %. Среду стерилизуют острым паром при 0,15 МПа в течение 1 ч. Схема выращивания: пробирки с агаризованной питательной средой ® пробирки с сыпучей питательной средой (1,0-1,5 г) ® 3-4 колбы вместимостью 750 мл (40-100 г питательной среды) ® посевные кюветы (3 колбы на 20-25 кювет). Площадь кювет 0,25-0,50 м2, высота слоя питательной среды – 2-2,5 см. Для каждого продуцента свои оптимальные условия культивирования. Количество посевного материала, передаваемое на стадию основного производства – 0,2-1 % (суспензия спор с титром 106 клеток/мл).
Стадия основной ферментации. Она включает совокупность операций от внесения в приготовленную и термостатированную среду инокулята и до завершения процесса роста, биосинтеза или биотрансформации. Поверхностный способ ферментации применяют для культивирования аэробных микроорганизмов (грибов) на сыпучих, увлажнённых до 45-56 % питательных средах на основе пшеничных отрубей, свекловичного жома, солодовых ростков, измельчённой соломы (поверхностное твёрдофазное культивирование) или на поверхности жидких питательных сред (поверхностное жидкофазное культивирование). Процесс проводят в кюветах из алюминия или оцинкованного железа. Площадь кювет – 0,25-0,5 м2, высота – 20-50 мм. Кюветы для сыпучих сред перфорированы – 2 х 20 мм. Время ферментации – от 20 до 72 ч.
Глубинный способ применяют для культивирования как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов. Культивирование проводят во всей толще среды в ферментаторах (биореакторах) объёмом от 0,01 до 100 м3, с высотой в 2-2,5 раза больше диаметра. Они снабжены перемешивающими и теплообменными устройствами, оборудованы системами подачи стерильного воздуха, питательной среды, пеногасителя, воды и пара, а также системами контроля и регулирования рН, температуры, окислительно-восстановительного потенциала и содержания О2. Время ферментации составляет от 24 до 72 ч (для актиномицетов – до 12 сут).
По способу перемешивания биореакторы подразделяют на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием. Аппараты с механическим перемешиванием имеют 2-3-х ярусные мешалки различных форм. Аппараты с пневматическим перемешиванием снабжены диффузорами и барботёрами. Аппараты с циркуляционным перемешиванием снабжены насосами, которые создают направленный поток культуральной жидкости по замкнутому контуру.
Различают периодическое и непрерывное глубинное культивирование. При периодическом способе культура проходит все стадии роста (лаг-фаза, фаза экспоненциального роста, фаза замедленного роста, стационарная фаза и фаза отмирания). Разновидности периодического культивирования: с подпиткой (до 25-30 % свежей питательной среды от первоначального объёма); отъёмно-доливное (от 30 до 60 % свежей питательной среды от её первоначального объёма); с диализом.
При непрерывном культивировании биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста за счёт притока свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и продукты их жизнедеятельности. Различают открытые и замкнутые системы ферментации. В первом случае – клетки постоянно вымываются из ферментатора со скоростью равной скорости роста (хемостат), а в замкнутых системах – количество клеток в ферментаторе нарастает. Непрерывный процесс может быть организован как гомогенно- и гетерогенно-непрерывный. При гомогенно-непрерывном процессе в ферментаторе с интенсивным перемешиванием все параметры постоянны во времени и пространстве (аппарат полного смешения). При гетерогенно-непрерывном в разных точках ферментатора параметры различны. Наример, тубулярный ферментатор, который представляет собой аппарат идеального вытеснения (по ходу аппарата культура проходит все фазы роста) или батарея последовательно соединённых ферментаторов. По способу подачи субстрата различают однопоточные и многопоточные системы ферментации. Кроме того, подразделяют системы с рециклом бесклеточной культуральной жидкости или биомассы продуцента.
Выделение и очистка продуктов микробиологического синтеза. Схема зависит от способа культивирования, характера продуктов роста и накопления их в среде культивирования, физико-химических свойств продуктов биосинтеза (метаболитов).