Основные понятия и положения темы.
Преимуществом ИФА перед классическими серологическими реакциями (РА, РНГА, РСК) является возможность определения количества антител (или антиген1. без использования серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, следовательно, количеству искомых антител (или антиген1.. Измеряя с помощью спектрофотометра оптическую плотность содержимого лунки и сравнивая ее с контролем, определяют количество искомого компонента.
Достоинством ИФА при серодиагностике инфекционных заболеваний является также возможность определения классов специфических антител (Ig M, Ig G, Ig A), что имеет значение для определения периода инфекционного процесса, выявления носительства возбудителя и контроля проводимой терапии.
При этом использование для постановки ИФА моноклональных антител позволяет достичь высокой специфичности, что в сочетании с высокой чувствительностью делает ИФА одним из наиболее распространенных методом в прикладной иммунологии.
В РИФ происходит взаимодействие антигенов и антител, меченных красителями, флюоресцирующими при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например, изотиоционат флюоресцина, дающий зеленовато-желтое окрашивание. С помощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антигенов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флюоресценции комплекса «антиген + антитело» в люминесцентном микроскопе. Лучше использовать моноклональные антитела, каждое из которых нацелено против единственного антигенного эпитопа и поэтому в отличие от поликлональных антител не будет давать нежелательных перекрестных реакций с другими микроорганизмами.
Самостоятельная работа по теме:
Учтите и оцените результаты РСК с гонококковым антигеном и сыворотками обследуемых.
РСК является сложной двухэтапной серологической реакцией, в которой участвуют две системы антиген + антитело и комплемент. Первая система – основная, содержит антиген, антитело и комплемент. В случае образования комплекса антиген + антитело происходит активация и связывание комплемента, но визуально этого не видно. В качестве индикаторной системы используется вторая система, содержащая в качестве антигена эритроциты барана, а антитела – гемолитическую сыворотку с антителами к эритроцитам барана, т. е. готовый иммунный комплекс. Если антиген и антитело в первой системе соответствуют друг к другу, то образующийся комплекс активирует и связывает комплемент, поэтому при добавлении индикаторной системы гемолиза не происходит (РСК положительная). Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то комплекс не образуется и комплемент остается свободным, активируясь и связываясь второй системой, вызывая при этом гемолиз эритроцитов (РСК отрицательная).
РСК требует особой подготовки. Все ингредиенты берут в определенном объеме (0,5 мл при бактериальных инфекциях, 0,1 мл – при вирусных инфекциях) и в определенном количестве, которое определяют путем титрования. Заполните дома таблицу 1.
Таблица 1.
| Ингредиенты РСК | Характеристика ингредиентов | |
| способ получения | рабочая доза | |
| Антиген | ||
| Сыворотка обследуемого (при серодиагностике) | ||
| Иммунная сыворотка (при сероидентификации) | ||
| Комплемент | ||
| Гемолизин | ||
| Эритроциты барана |
Схема постановки основного опыта РСК
| № системы | Ингредиенты, мл | Опыт | Контроли | |
| сыворотки | антигена | |||
| 1. | Исследуемая сыворотка в разведении 1:5 Антиген (рабочая доза) Комплемент (рабочая доза) Изотонический раствор хлорида натрия | 0,5 0,5 0,5 - 37° С – 1 ч | 0,5 - 0,5 0,5 | - 0,5 0,5 0,5 |
| 2. | Гемолитическая система* | 1,0 37° С – 1 ч | 1,0 | 1,0 |
Примечание: * - гемолитическую систему готовят, смешивая в равных количествах гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана; выдерживая смесь в течение часа при 37° С.
Результаты РСК предварительно учитывают после извлечения пробирок из термостата и окончательно – спустя 15-18 ч после пребывания их при комнатной температуре или в холодильнике.
Интенсивность реакции выражают плюсами:
++++ - реакция резко положительная, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (эритроциты оседают на дно, жидкость бесцветная);
+++ - реакция положительная, характеризующаяся частичным гемолизом (лизировано ~ 25% эритроцитов, осадок меньше, жидкость розовая);
++ - реакция положительная, характеризующаяся гемолизом (лизировано ~50% эритроцитов, осадок небольшой, жидкость розовая);
+ - реакция сомнительная (лизировано ~75% эритроцитов, незначительный осадок, жидкость интенсивно окрашен1.;
_ - реакция отрицательная (лизированы все эритроциты, жидкость интенсивно окрашена и прозрачна – лаковая кровь).
Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов. Заполните дома таблицу 2.
Таблица 2.
| № пп | Контроли | Контролируемое свойство |
| 1. | КС = С + К + Г + Э + физ. раствор | |
| КА = А + К + Г + Э + физ. раствор | ||
| 3. | КГС = К + Г + Э + физ. раствор | |
| 4. | КГ = Г + Э + физ. раствор | |
| 5. | КЭ = Э + физ. раствор | |
| 6. | КК = К + Э + физ. раствор |
Обозначения:
С – сыворотка; А – антиген; К – комплемент; Г – гемолитическая сыворотка;
Э – эритроциты; ГС – гемолитическая система.
Оценка результатов: положительная реакция с интенсивностью не меньше ++ при достоверных контролях свидетельствует о наличии антител и серологическом подтверждении клинического диагноза; отрицательная реакция при достоверных контролях свидетельствует о том, что антитела не выявлены и серологически клинический диагноз не подтвержден.
РСК используется, помимо диагностики хронической гонорее, при риккетсиозах, вирусных и других инфекциях.