Объектом изучения являются простейшие микроорганизмы, населяющие воду. Среди них – бактерии, вирусы, паразиты и микроскопические водоросли. Некоторые микробы не особо вредят человеку, к примеру, колиформы, но их наличие говорит о том, что в источник попадают фекалии животных. Иные простейшие (кишечная и синегнойная палочки, стрептококки, лямблии) являются возбудителями многих болезней, а значит, их присутствие в воде недопустимо.
Определение бактерий и патогенных микроорганизмов в пробе осуществляется посредством оптических, биохимических и прочих методов исследования[9]:
· Титрационного, или метода множества пробирок. Используются индикаторы среды, изменяющие окрас образца при соприкосновении с кислотами и продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Применяется для оценки качества колодезной, скважиной воды, а также образцов из бассейна, природных поверхностных источников.
· Метод АТФ. Используется специальный реактив — аденозинтрифосфорная кислота, с помощью которой можно выявить концентрацию биологических объектов в пробе. Измерение концентрации осуществляется прибором люминометром, поскольку микробы при воздействии АТФ продуцируют свет. Тест обязательно применяют для оценки качества технических и сточных вод, реже питьевой воды.
· Определение количества МАФАнМ в водопроводной воде. В чашку Петри с соблюдением правил асептики вносят 1 мл водопроводной воды без предварительного разведения, заливают расплавленным и охлажденным до температуры +50_С МПА (методом горячей заливки). Посевы инкубируют 24–48 ч в термостате при температуре +30_С. После указанного срока приступают к подсчету количества колоний, выросших как на поверхности, так и в глубине агара. Учитывают только те разведения, при посеве которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний. При посеве воды без разведений количество бактерий в 1 мл воды будет равно количеству выросших колоний. При определении количества МАФАнМ в воде открытых водоемов исследуемую воду предварительно разводят - 1:10-1 до 1: 10-4, из двух последних разведений вносят по 1 мл в стерильные чашки и заливают расплавленным и охлажденным до температуры +50_С МПА. После инкубирования притемпературе +30_С в термостате в течение 24–48 ч подсчитывают количество колоний, умножают на степень разведения воды и определяют количество бактерий в 1 мл воды открытых водоемов. Учету подлежат чашки Петри, в которых выросло от 30до 300 колоний. Колонии считают в каждой чашке отдельно, определяют среднеарифметическое число по двум чашкам. Полученное число умножают на степень разведения исследуемой воды и получают число бактерий в 1 мл воды.
· Мембранная фильтрация. Усовершенствованный чашечный метод подсчета. Образцы подвергаются вакуумной фильтрации. Применяются специальные мембранные фильтры, задерживающие микроорганизмы, которые в последствие выращиваются в питательной среде и рассматриваются специалистами под микроскопом. Метод позволяет определить вид и класс бактерий. Используется при оценке питьевых вод из любых источников.
· Выращивание в жидкой среде. Наиболее достоверным будет бактериальный анализ воды, который проводится посредством смешивания пробы с питательным, но жидким агаром. Смесь образца и среды разливается в специальную тару и запечатывается. В такой среде колонии размножаются активнее и быстрее.
· Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды.
Колититром называют наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Колииндекс показывает число кишечных палочек в 1000 мл воды.
Кишечная палочка является постоянным обитателем кишечника человека и животных, следовательно, ее присутствие в питьевой воде является индикатором фекального загрязнения, поэтому она отнесена к санитарно-показательным микроорганизмам. Чем выше концентрация бактерий группы кишечной палочки, тем вероятнее присутствие в исследуемой воде патогенных бактерий, таких как сальмонеллы, возбудители дизентерии и холеры. Показатели КТ и КИ указывают на санитарное состояние воды, ее пригодность в качестве питьевой.
Коли-титр и коли-индекс определяют двумя методами:
· метод бродильных проб;
· метод мембранных фильтров.
При исследовании чистой воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. Если вода содержит механические частицы, затрудняющие процесс фильтрации, лучше пользоваться бродильным методом.
1.Метод бродильных проб. Суть этого метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды в питательные среды накопления с индикатором и поплавками, инкубации ее при температуре +37_С, с последующим пересевом из забродивших пробирок на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и вычислении колититра воды по нормативам. Данный метод основан на ферментативной способности БГКП расщеплять при помощи ферментов лактозу или глюкозу до кислоты и газа. Исследуемая вода засевается в различных объемах в глюкозопептонную среду с индикатором и поплавками, при наличии кишечной палочки появляется помутнение, меняется цвет индикатора (желтый цвет переходит в красный) и появляются пузырьки газа в поплавках. Воду методом бродильных проб исследуют в три этапа (три дня):
· Первый день. Засевают водопроводную воду в объеме 333 мл (три объема по 100 мл, три — по 10 мл и три — по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 и 10 мл засевается в колбы и пробирки соответственно — с 10 и 1 мл концентрированной ГПС, а посев воды в объеме 1 мл— в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрацией (готовят как концентрированную, но количество всех ингредиентов, кроме воды, уменьшают в 10 раз). Посевы исследуемой воды в средах культивируют в термостате 24 ч при температуре +37_С.
· Второй день. Ведется учет результатов посева разных объемов воды, при котором:
¾ отсутствие помутнения, образования кислоты и газа в колбах и пробирках после посева воды свидетельствуют об отсутствии кишечной палочки в исследуемом объеме воды;
¾ помутнение питательной среды, изменение цвета индикатора на красный и появление газа в поплавках говорят о наличии кишечной палочки. Из каждого забродившего посева петлей делают пересев штрихом на агар Эндо, разделенный на сектора в чашках Петри, таким образом, чтобы появились изолированные колонии. Посевы культивируют 24 ч при температуре +37_С.
· Третий день. Ведется учет результатов посева на агаре Эндо, при котором:
¾ отсутствие роста на агаре Эндо или наличие колоний, не характерных для БГКП, говорит о том, что кишечной палочки в посевах нет;
¾ из колоний, характерных для бактерий БГКП (красных с металлическим оттенком), готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Идентифицируют культуру по оксидазному тесту, положительную реакцию на этот тест дают БГКП, которые не учитываются. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий с отрицательной реакцией на оксидазный тест позволяет дать положительный ответ на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды.
Для установления свежего фекального загрязнения делают посев воды в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым. Посевы культивируют при температуре +43_С для дифференциации кишечной палочки от хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре. Наличие мути и газа указывает на присутствие в воде бактерий — показателей свежего фекального загрязнения.
Суть данного метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема исследуемой воды на поверхности мембранных фильтров и выращивании их на поверхности агара Эндо с последующим учетом количества БГКП в 1 л воды.
Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность узнать ответ на 2_й день:
Первый день. Готовят прибор Зейтца: предварительно его протирают спиртовым тампоном, далее в пламени спиртовки обжигают металлические детали. Готовят мембранные фильтры № 3 из нитроцеллюлозы, с диаметром пор 0,7 мкм, которые задерживают на своей поверхности БГКП. Фильтры осторожно, не допуская скручивания, кипятят 10–15 мин в дистиллированной воде, затем с соблюдением правил асептики помещают на сетку фильтрационного прибора Зейтца матовой поверхностью вверх.
В воронку прибора наливают исследуемую воду, а в приемной колбе Бунзена создают вакуум при помощи водоструйного насоса. Исследуемая вода процеживается через мембранный фильтр и бактерии, находившиеся в ней, остаются на поверхности. После окончания фильтрации воды мембранный фильтр переносят на поверхность агара Эндо в чашках Петри. Чашки помещают в термостат при температуре +37_С на сутки. Через поры мембранного фильтра происходит диффузия питательных компонентов среды Эндо, вследствие этого оставшиеся БГКП размножаются и за сутки на поверхности фильтра каждая палочка образует типичные колонии — красные с металлическим оттенком, количество которых обязательно подсчитывают.
Второй день. Учитывают наличие или отсутствие колоний на поверхности фильтров, находящихся на агаре Эндо в чашках Петри:
-отсутствие колоний на поверхности фильтра или наличие колоний, не характерных для БГКП, позволяет дать отрицательный ответ на присутствие кишечной палочки в исследуемом объеме воды;
-при наличии на фильтре красных с металлическим блеском колоний их количество подсчитывают и из них готовят препараты, окрашивают, микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек ставят оксидазную пробу. Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде кишечной палочки.
В этом случае вычисляют коли-титр и коли-индекс исследуемой воды. Зная показатель коли-титра, можно определить коли-индекс: для перевода коли-титра в коли-индекс 1000 делят на показатель коли-титра, а для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли_индекс.[4]
Например, при исследовании пробы воды профильтровано 3 объема по 100 мл. На первом фильтре выросло 3 колонии, на втором фильтре — 2, на третьем — 10, т. е. в общей сложности на трех фильтрах выросло 15 колоний.
Колт-титр этой воды будет равен:
300/15 = 20 мл.
т. е. 20 мл — это наименьший объем воды, в котором находится одна кишечная палочка.
Теперь, зная коли-титр, мы определяем коли-индекс по формуле:
коли-индекс воды = 1000/коли-титр = 1000/20 = 50;
коли-титр воды = 1000/коли-индекс = 1000/50 = 20.
Таким образом, коли-индекс исследуемой воды равен 50, т. е. в 1000 мл воды находится 50 кишечных палочек. Такой водой пользоваться нельзя, так как коли-индекс питьевой воды должен быть не более 3.
.
Заключение
Опасное для здоровья людей снижение качества питьевой воды, вследствие интенсивного загрязнения источников водоснабжения и санитарно-эпидемиологического состояния водных объектов рекреационного назначения, является важнейшим фактором изменения среды обитания человека и играет важную роль при определении степени экологического неблагополучия территорий.
К микробиологическим показателям безопасности питьевой воды относят общее микробное число, содержание бактерий группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии и колифаги), споры сульфитредуцирующих клостридий и цисты лямблий.
Заключение о степени санитарно-экологического неблагополучия может быть сделано на основании стабильного сохранения негативных значений основных показателей в течение достаточно длительного периода (не менее одного года). При этом, как правило, отклонения от норм должны наблюдаться по нескольким показателям за исключением случаев загрязнения водных источников и питьевой воды патогенными микроорганизмами и возбудителями паразитарных заболеваний, а также особо токсичными (чрезвычайно опасными) веществами, когда заключение о неблагополучии может быть сделано на основании одного показателя.
Коли-индекс, коли-титр - количественные показатели фекального загрязнения воды и других объектов внешней среды. В качестве индикатора фекального загрязнения используется постоянный обитатель кишечника человека — кишечная палочка, так как она легко выращивается в обычных условиях на простых питательных средах. Количество этих бактерий позволяет судить о степени фекального загрязнения исследуемого объекта.
Список литературы
1. Биологические методы оценки качества объектов окружающей среды: учеб. пособие. В 2 ч. Ч. 2. Методы биотестирования / С. М. Чеснокова, Н. В. Чугай; Владим. гос. ун-т. – Владимир: Изд-во Владим. гос. ун-та, 2008. – 92
2. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / О.П.Мелехова, Е.И. Егорова и др. – М.:Издательский центр «Академия», 2007.-288с.
3. https://www.medicinformer.ru/medinfs-237-1.html
4. https://studopedia.ru/15_25468_infektsionnie-zabolevaniya-i-gelmintozi-peredavaemie-vodnim-putem.html
5. https://aqua-guru.ru/analiz/mikrobiologicheskij-analiz.html
6. https://ohranatruda.ru/ot_biblio/normativ/data_normativ/9/9742/index.php
7. https://www.cge58.ru/uploads/otbor-prob/new/microbiologicheskiy-analiz.pdf
8. https://ekolog.org/books/20/5_5.html
9. https://oskada.ru/analiz-i-kontrol-kachestva-vody/bakteriologicheskij-analiz-vody
10.obrazec-analiza-na-bakterialnye-endotoksiny.html
Приложения
Приложение 1
Критерии санитарно-гигиенической оценки опасности