Тема: Культивирование вирусов, риккетсий, хламидий.
Цель: Освоение методов культивирования вирусов, риккетсий, хламидий.
Модуль1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.
Содержательный модуль 3. Содержательный модуль 3. Физиология бакте-рий и вирусов.
Тема 14: Культивирование вирусов, риккетсий, хламидий.
Актуальность темы. В связи с отсутствием у вирусов метаболических систем, их репродукция может происходить только в живых клетках в виде продуктивного, интегративного и абортивного типа. Репродукция вирусов в процессе взаимодействия их с клеткой проходит в несколько этапов. Основные этапы взаимодействия вирусов с клетками при продуктивной инфекции: адсорбция, проникновение в клетку, “раздевание”, биосинтез компонентов вируса, образование вирусных частичек, выход вирусов из клетки. При интегративном типе взаимодействия вирусный геном (ДНК-провирус) функционирует как составная часть клеточного генома и клетка получает новые свойства, продолжая выполнять свои функции. Возникает персистенция вирусов. Абортивный тип взаимодействия возникает при проникновение вирусов в нечувствительные клетки, где невозможна репродукция вирусов.
Существуют такие методы культивирования вирусов: в клеточных культурах, в куриных эмбрионах, в организме лабораторных животных.
1. Методы культивирования вирусов в клетках наиболее распространенны.
Виды клеточных культур:
а) первичные - готовят из нормальных тканей эмбриональных или взрослых организмов путем трипсинизации, выдерживают 2-4 пассажа.
б) перевиваемые или пассажные - готовят из тканей злокачественных опухо-лей, выдерживают тысячи генераций (HELa);
в) полуперевиваемые - выдерживают до 70 пассажей (диплоидные клетки легких человека).
Для получения однослойной тканевой культуры используются пита-тельные среды: 199, Игла, Хенкса.
Выявление репродукции вирусов в культуре ткани:
а) по цитопатическому действию вирусов:
· полная или частичная деструкция монослоя;
· изменение формы клеток;
· возникновение многоядерных клеток и симпластов;
б) образование внутриклеточных включений - место усиленного размноже-ния вирусов и реакция клетки на внедрение вируса;
в) с помощью реакции гемадсорбции;
г) по цветной пробе;
д) выявление вирусного гемаглютинина или вирусного антигена в РГА и РСК;
е) выявление вирусных бляшек.
2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах используется огра-ниченно, так как только некоторые вирусы репродуцируются в тканях куриного эмбриона (вирус натуральной оспы, гриппа, герпеса простого, эпидемического паротита).
Место введения вирусосодержащего материала: а) в полость амниона и алантоисную; б) в желтковый мешок; в) в мозг, тело эмбриона; г) на хорионалантоисную оболочку.
Определение репродукции вирусов проводится по специфическим из-менениям в эмбрионе и с помощью РГА (вирус гриппа).
Специфические изменения в эмбрионе:
а) бляшки на хорионалантоисной оболочке (вирусы натуральной оспы и ос-повакцины);
б) диффузное помутнение оболочек;
в) появление кровоизлияний;
г) участки некроза.
3. Культивирование вирусов в организме животных (вирусы Коксаки, бешенства) имеет положительные стороны - доступность, четкость симпто-мов, моделирование инфекционного процесса, накопление вируса в большом количестве (для получения вакцин). Недостатки - не все вирусы можно куль-тивировать, лабораторные животные - открытая система, которая содержит собственную микрофлору, в том числе и латентные вирусы.
Культивирование риккетсий и хламидий проводится теми же методами, что и вирусов. Так, риккетсии можно культивировать в желточном мешке куриного эмбриону, в легких белых мышей и кишечника вшей. Хла-мидии также можно культивировать в желточном мешке куриного эмбриона и при внутримозговом заражении белых мышей.
Конкретные цели:
· Выучить методы культивирования вирусов в клеточных культурах, в куриных эмбрионах, в организме лабораторных животных.
· Выучить методы выявления репродукции вирусов в клеточных культурах, в куриных эмбрионах, в организме лабораторных животных.
· Выучить методы культивирования риккетсий.
· Выучить методы культивирования хламидий.
Теоретические вопросы:
1. Особенности размножения вирусов.
2. Современные методы культивирования вирусов.
3. Культивирование вирусов в курином эмбрионе.
4. Культивирование вирусов в клеточных культурах.
5. Характер ЦПД вирусов на клеточные культуры.
7. Методы культивирования риккетсий.
8. Методы культивирования хламидий.
Практические задачи, которые выполняются на занятии:
1. Микроскопия клеточных культур в норме и с цитопатическим действием вирусов, их анализ и зарисовывание в протокол.
2. Ознакомление со строением куриного эмбриона (схема).
3. Заражение куриных эмбрионов вирусом осповакцины в алантоисную полость.
4. Разрез куриных эмбрионов, которые раньше были заражены вирусом осповакцины.
5. Анализ изменений алантоисной оболочки зараженных эмбрионов, и запись выводов в протокол.
6. Оформление протокола.
Литература:
1. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбаков А.М. Микробиология.- М.: Медицина, 1998.- 336с.
2. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.: ГЕОТАФ-МЕД, 2001.- 768с.
3. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія.- К.: "Вища школа", 1992.– 431с.
4. Конспект лекций.
Дополнительная литература:
1. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с.
2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559с.
3. БМЭ, Т. 1, 2, 7.