Жданова А.А., лаб.-исс., Белякова К.Л., м.н.с., Тертычная Т.Е. лаб.-исс., Пятыгина К.М. лаб-исс., Милютина Ю.П. ст.н.с.




Протеомный анализ NK-клеток

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность исследования. Натуральные киллеры (NK-клетки) являются цитотоксическими клетками, которые активно участвуют в формировании иммунологической толерантности при беременности. Основные белки, осуществляющие их цитотоксическую функцию, известны и уже частично описаны в современной литературе. Однако NK-клетки, в особенности NK-клетки в зоне маточно-плацентарного контакта, участвующие в процессах формирования плаценты, на данный момент представляют интерес для полного протеомного исследования. Клетки линии NK-92, взятые для настоящего исследования, воспроизводят основные фенотипические и функциональные характеристики активированных NK-клеток.

Цель исследования: исследование белкового профиля клеток линии NK-92 при спонтанном культивировании с помощью масс-спектрометрического анализа после разделения белков методом 2D-электрофореза.

Материалы и методы исследования. Клетки линии NK-92 (ATCC, США) спонтанно культивировали, используя полную ростовую среду на основе минимальной среды Игла α-модификации (α-МЕМЕ), содержащую 12,5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 12,5% инактивированной лошадиной сыворотки, 500 Ед/мл рекомбинантного IL-2 («Ронколейкин», Биотех, Россия). Клетки культивировали во влажной атмосфере при 37 ОС, 5% СО2.

Клетки центрифугировали при 200g, после чего отмывали от среды фосфатным буфером PBS и замораживали либо в лизирующем буфере RIPA, либо в воде Nanopure Water (Bio-Rad, США). Замороженные в воде клетки разрушали методом замораживания-оттаивания с последующей гомогенизацией. Клетки концентрировали, после чего ресуспендировали в регидратирующем буфере, мембраны отделяли центрифугированием, супернатант отбирали для изоэлектрофокусирования. Определение концентрации общего белка в клетках линии NK-92 проводили методом Лоури.

Для разделения белковой смеси использовался метод двумерного электрофореза. Регидратацию на стрипах Mini-Protean 7 cm IPG strip, pH 3-10 (Bio-Rad, США) проводили в течение 12 часов, изоэлектрофокусирование проходило при 50 В*ч в течение 6 часов. После изоэлектрофокусирования проводили электрофорез второго направления, белки по молекулярной массе разделяли в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия при напряжении 200В. После электрофореза пятна белковых фракций вырезали и подвергали трипсинизации с использованием трипсина бычьего в 30 мМ Трис (рН 8,2).

Масс-спектрометрический анализ белков проводили на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре Agilent ESI-Q-TOF 6538 UHD (Agilent Technologies, США), совмещенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом Agilent 1260. Анализ масс-спектрометрических данных проводился в программе Spectrum Mill MS Proteomic Workbench с поиском по базе данных UniProt. После идентификации пептидов проверялось соответствие идентифицированного белка его реальному положению на геле.

Результаты исследования. Полученные после разрушения клеток с помощью лизирующего буфера RIPA электрофореграммы оказались недостаточно информативными по сравнению с разрушением клеток с помощью замораживания-оттаивания. Использование лизирующего буфера RIPA затрудняет прохождение изоэлектрофокусирования, особенно в диапазоне pH 8-10, где наблюдалось размывание белковых полос, что указывает на отсутствие нормального прохождения изоэлектрофокусирования в щелочной области. Отсутствие достаточного разделения белков в данном диапазоне pH, в котором, в частности, находятся изоэлектрические точки гранзимов, одних из основных цитотоксических белков NK-клеток, указывает на трудности, с которыми можно будет столкнуться при проведении исследований по изменению цитотоксичности NK-клеток в присутствии трофобласта. При этом метод замораживания-оттаивания позволил получить адекватную 2-D электрофореграмму протеома NK-клеток с возможностью идентификации и последующего анализа пятен методом масс-спектрометрии.

С помощью метода тандемной квадруполь-времяпролетной масс-спектрометрии были идентифицированы белки цитоскелета, ферменты гликолиза и другие белки, участники различных метаболических путей клетки.

Выводы. Метод масс-спектрометрического анализа позволил определить белковый профиль клеток линии NK-92 после их замораживания-оттаивания и дальнейшего разделения белков методом 2D-электрофореза.

Исследование выполнено с использованием оборудования РЦ РМиКТ СПбГУ. Работа поддержана грантами РНФ 17-15-01230 и РФФИ 17-04-00679.

 



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2017-06-11 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: