Радиоиммунологический анализ (РИА)




 

В качестве метки используются радиактивные изотопы (131I, 125 I, или 3 H и 14 C).

В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА:

1) техника «жидкая фаза» (классический РИА).

Недостаток этой техники постановки – необходимость специального разделения свободного и связанного меченного антигенов (или антител).

2)техника «твёрдая фаза»

АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) – стенках полистироловой лунке или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК.

В зависимости от характера реакции различают следующие методы:

1 ) Конкурентный метод – метод, основанный на конкуренции антигенов (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антителами или антител (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антигенами.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ (исследуемый материал – кровь, мокрота и др.) или АТ (сыворотка крови);

б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген или исследуемому АТ-у антитело, меченые радиоизотопом;

в) специфические АТ-ла или АГ-ны известной концентрации, связанные на сорбенте;

г) стандартный АГ или АТ (контрольный);

д) буферный раствор.

Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ (или АТ). Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ (или АТ). Чем больше содержание исследуемого АГ (или АТ), тем меньше меченного АГ (или АТ) связывается с АТ-м (АГ-м) на поверхности сорбента. Концентрацию меченного АГ (или АТ) определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ (АТ) в исследуемой пробе.

2) Неконкурентный метод.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ;

б) специфические АТ-а известной концентрации, связанные на сорбенте;

в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые радиоизотопом;

г) стандартный АГ;

д) буферный раствор.

К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.

3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) – наиболее распространённый метод.

Компоненты:

а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);

б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ).

в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченные радиоизотопами;

г) контрольные сыворотки (или АГ-ы)

д) буферные растворы

Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твёрдофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ- АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).

Достоинства РИА:

1) высокая специфичность и чувствительность

2) простота техники постановки

3) точность количественной оценки результатов.

4) легко поддаётся автоматизации

Недостаток: использование радиоактивных изотопов.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

 

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (см. прилож.3, рис.11 и 12).

Сущность ИФА аналогична РИА.

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

- простота методов оценки реакции;

- стабильность конъюгатов;

- легко поддаётся автоматизации.

Однако по сравнению с РИА отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

Конкурентный тип.

Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определение носительства HBs Ag.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;

2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;

3) конъюгат – мышиные моноклониальные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой

4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат

5) фосфатно – солевой буфер

6) контрольные сыворотки:

- положительная (сыворотка с HBs Ag)

- отрицательная (сыворотка без HBs Ag).

Ход работы.

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2) Инкубация 1 час при 370 С

3) Отмывание лунок.

4) Внесение конъюгата

5) Инкубация 1 час при 370 С

6) Отмывание лунок.

7) Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.

Механизм.

Реакция протекает в три фазы:

1) HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ - АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2) Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ-HBs Ag-anti HBs АТ, меченые пероксидазой).

3) ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип.

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.

Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ)

2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ-м).

4) ОФД

5) фосфатно-солевой буфер

6) контрольные сыворотки:

- положительная

- отрицательная

Ход работы.

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток

2) Инкубация 30 минут при 370 С

3) Отмывание

4) Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом

5) Инкубация 30 минут при 370 С

6) Отмывание

7) Внесение ОФД

Механизм.

Реакция протекает в 3 фазы:

1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ (АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ)

2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки

3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2017-06-11 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: