МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ЗАНЯТИЙ

(практические, семинарские, лабораторные)

Тема 30 – Завершение решение экспертной задачи. Определение в трупной крови концентрации карбоксигемоглобина- написание заключения аналитической диагностики.

Цель: ознакомить студентов с подготовкой проб к анализу и идентификацией в крови карбоксигемоглобина с использованием химических экспресс-методов.

Задачи обучения: научить студентов методам анализа карбоксигемоглобина в с использованием химических экспресс-методов.

Форма проведения: семинар, работа в малых группах и выполнение заданий парами студентов.

Задания по теме:

Задание 1 групповое обсуждение теоретических вопросов по теме занятия.

1. Определение СО в крови

2. Предварительные методы исследования (химические).

3. Экспресс-тесты на определение СО в крови

4. Другие химические пробы.

Задание 2. (для 2-х студентов).

Токсикологическая химия. Ситуационные задачи и упражнения. Под ред.Н.И. Калетиной.-М.-2007.-С.312. Задача № 7.

На ХТА доставлены: кровь и моча ребенка.

Обстоятельства дела.

Семья с ребенком 8 лет участвовала в пикнике в горах. При возвра­щении домой люди попали в снежные заносы и вынуждены были находиться в закрытом автомобиле с включенным мотором в течение 14 часов. После возвращения домой все чувствовали себя плохо. У взрослых кру­жилась голова, возникла рвота, мышечная слабость. У женщины на фоне низкого давления появилась боль в сердце. Ребенок впал в кому и был доставлен в больницу.

Информация.

При осмотре в больнице у ребенка кожа лица была сине-багрового цвета, а видимые слизистые оболочки — малиново-красного оттенка. В пробах с танином и фероцианидом калия кровь ребенка сохраняла розовый цвет.

Цель исследования: провести ХТА представленных биообъектов с использованием химических экспресс-методов.

Приведите схему химико-токсикологического анализа представленных биообъектов, опираясь на методологию системного химико-токсикологического анализа (СХТА).

Лаборатория работает согласно принципам GLP и оснащена аналитическим оборудованием в соответствии с современными рекомендациями TIAFT.

ПРИМЕЧАНИЕ

При решении задачи следует:

• представить информацию о выборе биообъекта, используя знания физико-химических свойств токсикантов, их токсикокинетики и метаболизма;

• представить информацию о способе пробоподготовки и изолирования (выделения) токсикантов, используя знания физико-химических свойств токсикантов и учитывая Ваш выбор последующих методов анализа;

• выбрать химические экспресс-методы определения токсикантов, учитывая их чувствительность и специфичность, преимущества и недостатки;

• обосновать выбор способа количественного определения, поэтапно изложить схему и процедуру его проведения, привести математические формулы; если необходимо, то произвести вычисления;

• представить интерпретацию полученных количественных результатов;

• дать заключение об обнаружении токсикантов.

Литература

1. Токсикологическая химия: метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие + СD/ под ред. Н.И. Калетиной. – М., 2008. – 1016 с. Переплет.

2. Токсикологическая химия: учебник / под ред. Т.В. Плетеневой. – 2-ое изд. – М., 2008. – 512 с. Переплет.

3. Крамаренко В. Ф. Токсикологическая химия / В. Ф. Крамаренко. - Киев, «Высшая школа», 1989.- 272с.

4. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия/ М.Д. Швайкова. - М., «Медицина», 1975.-376 с.

Контрольные вопросы:

1. Определение СО в крови

2. Предварительные методы исследования (химические).

3. Экспресс-тесты на определение СО в крови

4. Другие химические пробы.

5. Заключение об обнаружении токсикантов. Судебно-медицинская оценка результатов определения.

ПРИЛОЖЕНИЕ

1. Определение СО в крови

Для определения СО в крови можно использовать различные методы, включая предварительные пробы, спектрофотометрию, газовую хроматографию и специальные методы. Определение СО в крови проводят либо по СО, либо выделяют из пробы крови газобразную смесь СО, СО,. О,, N.. измеряют количество газа и тем или иным способом устанавливают содержание в нем оксида углерода (II).

Предварительные методы исследования (химические). При выполнении нижеуказанных реакций параллельно исследуют два образца — кровь, не содержащую НbСО. и кровь пострадавшего при отравлении. В образцы добавляют одинаковые объемы реактивов и наблюдают за изменением окраски. Изменение окраски происходит только в образцах с нормальной кровью. Окраска образцов крови пострадавшего при отравлении не изменяется или изменяется незначительно.

Экспресс-тесты, или пробы, проводят непосредственно на месте происшествия или сразу после поступления пострадавшего в клинику. Цель — быстро установить наличие НbСО.

Тест 1. К 15 мл воды добавляют 1—2 капли исследуемой крови и отдельно донорскую кровь, пробирки встряхивают. В норме проба светло-розового цвета, при наличии НЬСО — вишнево-красного. Затем добавляют 5 капель 20% раствора гидроксида натрия. После энергичного встряхивания при наличии НЬСО в течение нескольких секунд сохраняется светло-розовый цвет (концентрация НbСО не менее 20%). Если светло-розовый цвет перейдет в соломенно-желтый, в крови нет НbСО или его содержится менее 20%. Проводят контрольную пробу с донорской кровью.

Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 755

Тест 2. В две пробирки вносят по 10 мл дистиллированной воды, затем в первую — 5 капель анализируемой пробы (кровь) и 5 капель свежеприготовленного раствора сульфида аммония, во вторую — 5 капель донорской крови и 5 капель свежеприготовленного раствора сульфида аммония. После осторожного перемешивания добавляют в обе пробирки по 2—3 капли 30% раствора уксусной кислоты. Анализируемая проба при наличии НЬСО окрашивается в крас­ный цвет, контрольная проба (донорская) — в грязно-зеленый.

Тест 3. К 5 мл крови (анализируемой пробы и донорской), разбавленной в 100 раз дистил­лированной водой, добавляют 5 капель концентрированного раствора сульфида меди. Дли­тельно и энергично встряхивают. Кровь, содержащая НЬСО. красного цвета, не содержащая — зеленого.

Тест 4. К 1 капле крови (анализируемой пробы и донорской) добавляют 40 капель воды и 5 капель 40% раствора фенилгидразина. Кровь, содержащая НЬСО. светло-красная, не содержащая НЬСО — темно- или черно-красная.

Тест 5. К 5 мл крови (анализируемой пробы и донорской), разведенной 100 раз, добавляют 5 капель 1% раствора гексаиноферрата (III) калия. Кровь, содержащая НЬСО, вишневого цвета, не содержащая — светло-коричневого (железо гемоглобина окисляется до Ре").

Другие химические пробы. Исследуемую кровь и контрольную кровь из печени животного в количестве 2—5 мл разбавляют 100 мл воды. При этом кровь, содержащая НЬСО. имеет ярко-красный цвет, контрольная кровь — буроватый оттенок.

Затем проводят следующие химические реакции.

• К разбавленным в соотношении 1:100 пробам испытуемой и контрольной крови прибавляют равные объемы 30% раствора гидроксида натрия. Кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет розовую окраску, контрольная принимает зеленовато-черную окраску.

• К разбавленным в соотношении 1:4 пробам испытуемой и контрольной крови прибавляют приблизительно по 3 объема 1% раствора танина и взбалтывают. Кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет розовый цвет; контрольная принимает серую окраску.

• К разбавленным в соотношении 1:20 пробам испытуемой и контрольной крови прибавляют равные объемы 20% раствора гексаиноферрата (III) калия и 2 мл разведенной 1:2 уксусной кислоты. Кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет розовый цвет, контрольная приобретает бурую окраску.

• Контрольная кровь, смешанная с 5 частями раствора основного ацетата свинца, принимает грязно-зеленую окраску, кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет свой цвет.

• Контрольная кровь после разбавления формалином спустя короткое время принимает грязно-бурую окраску, кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет красный цвет в течение нескольких недель.

Реакции можно проводить, смочив разведенной кровью белую фильтровальную бумагу, нанося затем на нее реактивы. Описанные реакции малопригодны для обнаружения малых количеств НЬСО в крови.

Судебно-медицинская оценка результатов количественного определения карбоксигемоглобина и карбоксимиоглобина

• Содержание НbСО в крови зависит прежде всего от концентрации СО во вдыхаемом воздухе и времени его воздействия.

• Концентрация НbСО тем выше, чем выше парциальное давление СО в альвеолярном воздухе по сравнению с парциальным давлением О,.

• За один и тот же промежуток времени при прочих равных условиях СО поступает в организм тем больше, чем больше минутный объем дыхания.

• Соответствие между концентрацией НЬСО и тяжестью отравления имеется не всегда. Это особенно отчетливо проявляется при групповых отравлениях.

• Смертельная концентрация НbСО в крови составляет в среднем около 60%, но может коле­баться от 40 до 80% и более, что обусловлено влиянием внешних условий и особенностями организма.

• Тяжесть острого отравления СО усиливается при низком барометрическом давлении, повы­шенной влажности, высокой или низкой температуре воздуха, усиленной мышечной работе.

• При смертельном отравлении порог насыщения НbСО у пожилых людей ниже. У женщин отравление протекает легче, чем у мужчин. Беременные женщины более чувствительны, чем небеременные. Лица, подвергавшиеся хроническому воздействию СО, тяжелее переносят острое отравление.

• Острое отравление проходит тяжелее у лиц, страдающих заболеваниями легких, сердца, нарушениями кровообращения, неврастенией, ожирением, анемией, перенесших черепно-мозговую травму, во время инфекционных заболеваний.

• Данные о влиянии алкогольной интоксикации на тяжесть отравления СО противоречивы.

• При сочетанном отравлении СО и оксидами азота, СО,, парами бензина, НСN (например, в результате пожара или технологического процесса) к смертельному исходу может привести относительно невысокая концентрация НbСО.

• Необходимо учитывать очень разную чувствительность отдельных лиц к действию СО. При групповых отравлениях у некоторых лиц, находящихся в коматозном состоянии, содержание НЬСО бывает гораздо ниже, чем у лиц, перенесших тяжелое отравление и при этом чувствующих себя удовлетворительно.

• Изредка встречаются атипичные формы отравления, протекающие с быстрой потерей созна­ния или тяжелыми расстройствами дыхания и сердечной деятельности (СО в крови 30%).

• Количественное содержание НbСО в крови, по-видимому, может зависеть от того, из какого участка кровеносной системы взята для исследования кровь. При вскрытии трупа кровь для исследования надлежит брать из правого предсердия (при наличии в нем крови) или бедренной вены либо из другого магистрального сосуда, а также из грудной или брюшной полости (при наличии излившейся в нее крови).

• В некоторых случаях целесообразно измерять содержание НbСО в гематомах и кровоподте­ках, так как оно может служить одним из признаков определения времени их возникновения. Считают, что гематомы, в которых содержание НbСО менее 10%. возникли до воздействия СО. Если содержание НbСО в них превышает 20%, то образование гематом связано с отравлением СО.

• В воздухе промышленных городов постоянно содержится СО, вследствие чего в крови жи­телей обычно находится некоторое количество НbСО. Между концентрацией НbСО и степенью загрязнения воздушной среды СО отмечена прямая зависимость. Например, в крови регулировщиков уличного движения содержание НbСО может достигать 22%.

• При освидетельствовании лиц, перенесших отравление СО, нужно иметь в виду, что при интоксикации средней степени в течение первого часа выделяется около половины посту­пившего в организм СО. Полное освобождение организма от СО наступает спустя 10—12 ч, но может затягиваться и до 24 ч.

• При обнаружении в крови трупа менее 60% НbСО необходимо проанализировать патологоанатомические данные и обстоятельства отравления, чтобы обосновать заключение о причине смерти.

• При повышении поступления СО в организм соответственно увеличивается содержание СО в тканях.

• Необходимость в исследовании скелетных мышц трупа или его частей возникает в очень редких случаях (например, при гнилостных изменениях резко обескровленных частей трупа) потому, что для определения НbСО спектрофотометрическим методом необходим всего 1 мл крови из свежего или хранившегося до 10 дней биологического материала.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Cпектроскопический метод обнаружения оксида углерода (II) в крови (Крамаренко В.Ф. Токс.химия.- Выша школа.-Киев.-1989.-С.415-424)

В крови лиц, отравленных оксидом углерода (II), не весь гемоглобин превращается в карбоксигемоглобин. Смерть наступает значительно раньше, чем достигается полное превращение оксигемоглобина в карбоксигемоглобин.

Карбоксигемоглобин можно обнаружить в крови спектроскопом, который является прибором для визуального спектрального определения ряда веществ, в том числе и карбоксигемоглобина.

При рассматривании крови спектроскопом наблюдаются линии и полосы, позволяющие сделать вывод о наличии или отсутствии карбоксигемоглобина.

Подлежащую исследованию кровь разбавляют водой до тех пор, пока не будет получен раствор, имеющий светло-розовую окраску. При спектроскопическом исследовании этого раствора четко видны соответствующие спектральные полосы.

Спектр оксигемоглобина крови ОНb имеет две полосы поглощения между линиями Фраунгофера D и Е при длинах волн 577—589 и 536—556 нм. Спектр карбоксигемоглобина СОНb име­ет две полосы поглощения при длинах волн 564—579 и 523—536 нм.

После прибавления одного объема свежеприготовленного раствора сульфида аммония (NH₄)₂S или других восстановителей (дитионит натрия Na₂S₂O₄-21-0 и др.) к четырем объемам вод­ного раствора исследуемой крови оксигемоглобин (ОНb) превра­щается в дезоксигемоглобин Нb, в спектре которого имеется одна широкая полоса поглощения при 543—596 нм. Карбоксигемоглобин не восстанавливается сульфидом аммония и другими восстановителями. Поэтому после прибавления восстановителей полосы поглощения карбоксигемоглобина не исчезают.

Таким образом, после прибавления раствора сульфида аммония к крови, содержащей окси- и карбоксигемоглобин, сохраняются две полосы поглощения карбоксигемоглобина, но исчезают полосы поглощения оксигемоглобина, а вместо них появляется широкая полоса поглощения дезоксигемоглобина. По наличию соответствующих полос поглощения в спектре крови делают вывод об отравлении оксидом углерода (II).

Спектральный метод оправдывает себя при исследовании крови, содержащей 10—30 % карбоксигемоглобина.

Оптические методы (Калетина Н.И.-Метаболизм и определение токсикантов.-М.-2007.-С.-753-759)

Объектами исследования на СО являются главным образом кровь пострадавшего и воздух производственных или жилых помещений, содержащий СО.

Диагностическое значение имеет определение НbСО в крови, взятой непосредственно на месте происшествия, так как при оказании пострадавшему первой помощи происходит частичная элиминация угарного газа и снижается содержание НbСО в крови. Спектрофотометрический метод определения СО наиболее распространен, потому что все гемоглобиновые структуры имеют абсорбцию в определенной части спектра.

Количественное определение в крови НbСО спектрофотометрическим методом

При добавлении восстановителя (натрия тиосульфата) к исследуемой крови окси- и метгемоглобин количественно образуют восстановленную форму гемоглобина. Последняя имеет спектр поглощения, представленный на рис. 1.

СО имеет большее сродство к гемоглобину, чем кислород, поэтому комплекс НbСО не можег быть разрушен тиосульфатом натрия. Таким образом, после обработки тиосульфатом натрия комплекс НbСО проявляется характерным спектром с двумя максимумами поглощения (рис. 8-16, А). Максимальная разница оптической плотности между спектрами А и Б отмечается при длине волны 540 нм, тогда как при длине волны 579 нм оптическая плотность практически одинакова. Процентное содержание СО в крови (см. рис. 1. А) может быть вычислено по формуле, исходя из значения оптической плотности «здоровой», не содержащей НbСО крови (см. рис. 1. Б), и исследуемого образца (см. рис. 1. В) после добавления тиосульфата натрия:

Рис. 1. Уф-спектры НЬСО (А), восстановленного гемоглобина (Б) и крови паписта при отравлении угарным газом (В).

 

Интерпретация результатов

• Содержание СО в крови < 5%: норма; для курящих до 10%.

• Содержание СО в крови 10—20%: интоксикация легкой степени.

• Содержание СО в крови 20—30%: интоксикация средней степени.

• Содержание СО в крови 30—40%: интоксикация средней степени, но возможен коллапс.

• Содержание СО в крови 40—50%: интоксикация средней степени, выраженные расстройс­тва дыхания и функций сердечно-сосудистой системы, часто коллапс, возможна смерть.

• Содержание СО в крови 50—60%: интоксикация сильной степени — кома, судороги, воз­можна смерть.

• Содержание СО в крови 60—90%: смерть

Газохромотографический метод

Газовая хроматография является достаточно простым и прямым методом определения об­щего количества СО в крови. Высвобождение СО из НbСО крови достигается обычно добавлением растворов натрия карбоната или некоторых других веществ. Газовая фаза вводится в хроматограф, снабженный детектором по теплопроводности. Концентрация СО определяется по калибровочному графику после расчета площади пика. Результаты метода достоверны при концентрации НbСО 30—100%. Ошибка при использовании метода составляет 10%.

Другой вариант газохроматографического определения СО в крови основан на переведении его в метан или С0₂ за счет каталитического восстановления водородом или окисления на силикагеле с пятиокисью йода.

В первом случае после высвобождения СО из крови в реакторе-дозаторе гелием газовую смесь мгновенно выталкивают из реактора в хроматографическую колонку, где СО каталитически восстанавливается водородом до метана и регистрируется ПИД.

Во втором случае С0₂ и СО разделяются на одной колонке с силикагелем, а затем в ячейке с пятиокисью йода СО окисляется до СО, и последний регистрируется детектором. Разница ве­личин интенсивности пиков до и после окисления позволяет установить концентрацию СО.