Определение осмотической резистентности эритроцитов
Принцип метода. Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипотонических растворах хлорида натрия.
Модифицированный метод Идельсона
Реактивы. Готовят основной раствор следующего состава (по осмотической концентрации соответствующий 10% раствору хлорида натрия): двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4) – 27,31 г, однозамещенный фосфат натрия (NaH2PO4∙Н2О) – 4,86 г, хлорид натрия – 180 г, дистиллированная вода – до 2 л (он может храниться в закрытой посуде в холодильнике до нескольких месяцев). Основной раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой для получения раствора, идентичного по осмотической концентрации 1% раствору хлорида натрия – из этого раствора готовят рабочие растворы хлорида натрия следующих концентраций: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20 и 0,10% (они могут храниться в течение 2 недель).
Ход определения. В 2 стерильные пробирки с предварительно внесенными 2 каплями гепарина помещают по 1,5 мл крови, содержимое пробирок перемешивают. Затем в 14 центрифужных пробирок разливают по 5 мл подготовленных рабочих 1-0,10% растворов хлорида натрия, добавляют по 0,02 мл гепаринизированной крови и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. После этого пробирки центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин, надосадочную жидкость сливают и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы – надосадочной жидкости из пробирки, содержащей 1% забуференный раствор хлорида натрия.
За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке с 0,10% забуференным раствором хлорида натрия. Вычисляют % гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величину экстинции надосадочной жидкости из этих пробирок с экстинцией, принятой за 100%, по формуле:
где
Е1 – экстинция надосадочной жидкости из пробирки с 0,10% забуференным раствором хлорида натрия,
Ех – экстинция исследуемой пробы,
100 - % гемолиза в пробирке с 0,10% забуференным раствором хлорида натрия.
На следующие день повторяют исследование с кровью, выдержанной в термостате при 370С в течение 24 ч, поскольку в ряде случаев понижение ОРЭ выявляется только при исследовании инкубированной крови.
Микроскопический метод Яновского
Реактивы. 3 раствора хлорида натрия следующих концентраций:
- 0,50% - раствор, в котором гемолиз нормальной крови возможен,
- 0,40% - раствор, в котором при обычных условиях гемолиз достаточно выражен,
- 0,46% - промежуточный раствор.
Ход определения. Испытуемую кровь набирают в 4 смесителя для эритроцитов до метки «0,5». В 3-х из них разводят кровь 0,50%, 0,46% и 0,40% растворами хлорида натрия, а в 4-м – 3% раствором хлорида натрия до метки «101» (разведение 1:200). Либо смешивают растворы хлорида натрия указанных концентраций с 0,02 мл крови в пробирках.
Проводят подсчет эритроцитов в камере Горяева. По результатам подсчета сначала вычисляют % устойчивых эритроцитов по отношению к их общему количеству в крови (к количеству эритроцитов в 3% растворе хлорида натрия, принимаемому за 100%), затем путем вычитания полученной величины из 100 - % гемолизированных клеток, т.е.
.
Результат выражают графически, для чего на ось абсцисс наносят значения концентрации использованных растворов хлорида натрия, на ось ординат - % гемолизированных эритроцитов (рис. 6).
Пример.
| [NaCl] | % гемолиза | Количество эритроцитов, ∙1012/л |
| 3 % | 8,53 | |
| 0,50% | 7,97 | 7,85 |
| 0,46% | 35,53 | 5,50 |
| 0,40% | 82,41 | 1,50 |
Рис. 6. Распределение эритроцитов периферической крови
в зависимости от осмотической резистентности
У здоровых лиц начало гемолиза отмечают при концентрации хлорида натрия 0,50-0,45% (верхняя граница резистентности или минимальная резистентность – гемолизируют наименее резистентные эритроциты), полный гемолиз – при 0,40-0,35% (нижняя граница резистентности или максимальная резистентность – гемолизируют наиболее резистентные эритроциты). Интервал между верхней и нижней границами резистентности называют амплитудой резистентности эритроцитов, а интервал между изотонической точкой (0,85% NaCl) и верхней границей резистентности – зоной резистентности (стойкости) эритроцитов.
А) норма
Б) снижение осмотической резистентности - гемолитическая анемия (наследственный микросфероцитоз, АИГА)
