В два флакона - № 1 «опытный»; № 2 - «контрольный» помещают по 5 мл питательной среды Игла с антибиотиками (100 ЕД пенициллина + 50 ЕД стрептомицина) и добавляют в каждый поОД мл гепарини-зированной крови больного. Затем в «опытный» (№ 1) флакон помещают 0,1 мл раствора ФГА, а в «контрольный» (№ 2) флакон - ОД мл физиологического раствора.
Флакон закрывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 72 часов.
После указанного срока инкубации культуры центрифугируют и из лейкоцитарной пленки на предметной стекле готовят мазки. Полученные мазки (в течение 15 минут) фиксируют в смеси Никифорова), а затем окрашивают по Романовскому.
Работа, выполняемая студентами:
Задача: необходимо провести микроскопический учет результатов реакции РБТЛ.
В готовых мазках больного (методику подготовки см. выше) определяют % властных форм лимфоцитов, встречающихся на 100 лимфоцитов.
Переход лимфоцитов из покоящегося состояния в бластные формы, способные к пролиферации и дифференцировке называется бласт-трансформацией. Данное явление сопровождается морфологическими изменениями лимфоцитов: увеличением их размеров, размеров ядра, количества митохондрий, рибосом, укрупнением лизосом.
Сделайте заключение о состоянии популяции Т-лимфоцитов у больного с СКВ, если известно, что ФГА в норме трансформирует в бласты 70-80% лимфоцитов.
Вопросы по эксперименту
1. Что такое митоген? Виды митогенов?
2. Существуют специфические и неспецифические стимуляторы бла-сттрансформации. Назовите вам известные?
3. Считают, что механизмы антигенной и митогенной стимуляции близки. Попытайтесь их объяснить?
4. Обоснуйте, для больных с какими аллергическими заболеваниями показано проведение РБТЛ, а для каких нет?
5. Какую помощь ожидаете получить от такого лабораторного исследования (РБТЛ) Вы, как будущий врач - в постановке диагноза, установлении ведущего механизма патогенеза, выявлении этиологического фактора?
Задание № 2. Выявление аутоангител (реакция Кумбса) в крови экспериментального животного с гемолитической анемией
Принцип реакции Кумбса заключается в том, что сенсибилизированные эритроциты, на поверхности которых фиксированы ауто-антитела, агглютинируют при добавлении к ним антиглобулиновой сыворотки, содержащей специфические антитела. Антиглобулиновую сыворотку получают от другого вида животных (чем экспериментальное) иммунизацией их сьшороткои крови или глобулином экспериментального животного.
Различают:
1. прямую реакцию Кумбса - для выявления аутоантитсл, фиксированных на эритроцитах;
2. непрямую реакцию Кумбса - для выявления аутоакткгел в сыворотке крови.
Предварительная подготовка (проводится лаборантами).
В организме экспериментального животного (крыса породы Wistar) моделируют гемолитическую анемию. Гемолитическая анемия вызывается подкожным введением 2,5% раствора солянокислого фе-нилгидразина (из расчета 0,06 мл на 100 г. веса животного) в течение 3-хдней.
Из цельной крови экспериментального животного с фенилгидрази-новой анемией извлекают эритроциты. Эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором. Из «отмытых» таким образом эритроцитов готовят 5% взвесь.
Подобным же образом готовят 5% взвесь из эритроцитов здоровой крысы (без гемолитической анемии). Данная 5% взвесь эритроцитов будет выступать в качестве контроля (при постановке реакции Кум-бса), а также будет использована в непрямой реакции Кумбса.
Антиглобулиновую сыворотку получают путем иммунизации кролика глобулинами крысы.
Экспериментальная работа, выполняемая студентами.
Постановка прямой реакции Кумбса.
1. На предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов крысы с экспериментальной гемолитической анемией.
2. Добавляют во взвесь эритроцитов одну каплю антиглобулиновой сыворотки. Образовавшуюся смесь аккуратно перемешивают чистой стеклянной палочкой.
3. Расположив предметное стекло на столике микроскопа отмечают время появления первых агглютинатов. Появление агглютинатов указывает на положительную реакцию. Скорость появления агглютинатов свидетельствует о степени сенсибилизации эритроцитов, т.е. о количестве аутоантител на их поверхности:
До 5 минут - реакция резко положительная (+ + +) 5-10 минут - реакция положительная (+ +) 10-15 минут - реакция слабоположительная(+) до 20 минут - реакция сомнительная (+ -).
4. Тоже самое (п. 1-3) проводят с 5% эритроцитарной взвесью здоровой крысы (служит контролем).
5. Сравнивают результаты прямой реакции Кумбса у здоровой и больной гемолитической анемией крыс.
Постановка непрямой реакции Кумбса.
1. Берут 5% взвесь эритроцитов здоровой крысы.
2. Из сыворотки крови животного с гемолитической анемией готовят ряд разведений (в физиологическом растворе): 1:2; 1:4; 1:8; 1:16.
3. В каждое разведение (пробирку) добавляют по 0,05 мл 5% взвеси эритроцитов здоровой крысы.
4. Пробирки помещают в термостат (Т=37°С) на 1 час. Считается, что в течение 1 часа антитела из сыворотки крови больного животного адсорбируются на эритроцитах здоровой крысы.
5. После часового контакта эритроцитов с сывороткой, эритроциты трижды отмывают в физиологическом растворе.
6. На предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов крысы.
7. Добавляют во взвесь эритроцитов одну каплю антиглобулиновой сыворотки. Образовавшуюся смесь аккуратно перемешивают чистой стеклянной палочкой.
8. Расположив предметное стекло на столике микроскопа отмечают время появления первых агглютинатов.
9. Об активности реакции судят по титру разведения сывороток, где появились первые агглютинаты
1:2- сомнительная (+ -)
1:4- слабоположительная(+)
1:8- положительная (+ +)
1:16- резко положительная (+■+ +) ■