Педиатрия
ЗАНЯТИЕ 9
Тема: МЕТОДЫОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
Цель: Освоить методы оценки неспецифических и специфических факторов защиты организма человека.
Знать: Неспецифические и специфические факторы защиты организма человека и методы их изучения.
Уметь:
1. Определить неспецифические гуморальные и клеточные факторы защиты организма человека.
2. Учесть и оценить результаты реакции розеткообразования для определения процентного содержания Т- и В-лимфоцитов.
Контрольные вопросы:
1. Понятие «иммунитет» и его виды.
2. Неспецифические клеточные факторы иммунитета человека: кожа и слизистые оболочки; нормальная микрофлора; фагоцитоз; их характеристика.
3. Виды фагоцитирующих клеток, стадии фагоцитоза, завершенный и незавершенный фагоцитоз.
4. Неспецифические гуморальные факторы иммунитета человека: комплемент, лизоцим, пропердин, интерферон, железосвязывающие белки и др.; их характеристика.
5. Центральные и периферические органы иммунной системы.
6. Основные клетки иммунной системы: Т- и В-лимфоциты, макрофаги.
7. Т-лимфоциты. Субпопуляции Т-клеток: Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки (Т-эффекторы); поверхностные маркеры и рецепторы этих клеток (СД-антигены). Продукты и функции Т-лимфоцитов.
8. В-лимфоциты. Субпопуляции В-клеток. Поверхностные маркеры и рецепторы В-клеток: иммуноглобулины, Fc-рецепоры, рецепторы для комплимента и др. Продукты и функции В-лимфоцитов.
9. Взаимодействие Т-, В-лимфоцитов и макрофагов в процессе иммунного ответа.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Определить бактерицидные свойства кожи.
2. Определить наличие лизоцима в слюне.
3. Определить фагоцитарную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов.
4. Определить содержание Т-лимфоцитов в крови обследуемого.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
I. Определение бактерицидных свойств кожи.
Учет результатов по определению бактерицидных свойств кожи с использованием тест-культуры Sarcina flava проводится через 18-24 ч после термостатирования посевов при 37°С:
- I сектор – рост нормальной микрофлоры кожи;
- II сектор – рост тест-культуры сарцины;
- III сектор – отсутствие роста сарцины и рост нормальной микрофлоры или рост сарцины
разной степени интенсивности и рост нормальной микрофлоры.
Оценка результатов: отсутствие роста сарцины в III секторе спустя 30 мин, свидетельствует о бактерицидных свойствах кожи; наличие роста сарцины свидетельствует о снижении бактерицидных свойств кожи.
Неповрежденные кожа и слизистые оболочки являются барьером для проникновения микроорганизмов. Причем, они являются не только механическим барьером, а снабжены активными механизмами: на коже это жирные кислоты (секрет сальных желез), молочная кислота, NaCl (секрет потовых желез), нормальная микрофлора. На слизистых это лизоцим, пероксидаза, лактоферрин (слюна, слезы и др.), соляная кислота (желудочный сок), нормальная микрофлора. Поэтому условием проникновения в организм большинства возбудителей является повреждение кожи и слизистых оболочек.
II. Определение наличия лизоцима в слюне.
Учет и оценка результатов по определению лизоцима в слюне с использованием тест-культуры Micrococcus luteus проводится через 18-24 часа после термостатирования при 37°С: по всей поверхности чашки отмечается рост микрококка, а в месте нанесения слюны роста тест-культуры нет, но имеется рост нормальной микрофлоры полости рта, нечувствительной к лизоциму.
Лизоцим является одним из важнейших компонентов слюны, определяющий ее бактерицидные и бактериостатические свойства. Концентрация лизоцима в слюне взрослых составляет 59-139 мкг/мл; в сыворотке крови взрослого – 4-10 мкг/мл, в молоке кормящей матери - 75 мкг/мл. Лизоцим является ферментом мурамидазой, расщепляющим гликозидные связи в молекуле муреина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. Он вызывает бактерицидный эффект, в первую очередь, в отношении грамположительных бактерий, причем резидентная микрофлора различных экотопов устойчива к действию лизоцима.
III. Определение фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов.
Фагоцитоз – является одним из основных клеточных неспецифических механизмов защиты организма человека. Для определения активности фагоцитоза кровь или взвесь лейкоцитов обследуемого инкубируют с частицами латекса, после чего из смеси готовят тонкий мазок и окрашивают его по методу Романовского-Гимзе.
Промикроскопируйте готовые препараты для определения активности фагоцитоза лейкоцитов крови с использованием частиц латекса, учтите и оцените полученные результаты.
Критерии учета: подсчет поглощенных частиц латекса ведут в 100 нейтрофилах. Интенсивность реакции оценивают по следующим показателям:
1) фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) – процент нейтрофилов, содержащих частицы латекса;
2) фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) – среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом.
Критерии оценки: интенсивность реакции фагоцитоза в норме – фагоцитарный показатель у детей 60%, у взрослых 75-80%, фагоцитарное число – у детей 12, у взрослых 14-15 (региональные показатели по данным Центра СПИД, г. Красноярск).
IV. Определение содержания Т-лимфоцитов в крови обследуемого.
Для определения процентного содержания Т-лимфоцитов учтите и оцените результаты реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).
Т- и В-лимфоциты выявляют по их способности фиксировать на своей поверхности соответственно эритроциты барана и мыши с образованием розеток (Е-РОК). В-лимфоциты, обладающие рецепторами для иммуноглобулина G и комплемента выявляют также по способности формировать розетки с эритроцитами, погруженные этими белками (ЕАС-РОК).
Для постановки Е-РОК с целью определения Т-лимфоцитов смешивают лимфоциты, выделенные из крови обследуемого и эритроциты барана, инкубируют при 4°С и центрифугируют. Эритроциты присоединяются к специальным рецепторам на мембране Т-лимфоцитов, образуя так называемые розетки. Осадок, содержащий розетки, осторожно ресуспендируют и готовят мазки, которые окрашивают метиленовым зеленым, пиронином.
Учет результатов: подсчитывают количество розеткообразующих клеток на 100 лимфоцитов и выражают в процентах. Розеткообразующим считают лимфоцит, присоединивший не менее 3-х эритроцитов барана.
Оценка результатов: у здоровых людей Т-лимфоциты составляют 40-70% от общего числа лимфоцитов, В-лимфоциты – 10-30%.
Вопросы для самоконтроля:
1. Пути активации комплемента и механизм его бактерицидного действия. Какой путь активации является врожденной реакцией иммунитета.
2. Чем объясняется более высокая активность лизоцима в отношении грамположительных микроорганизмов?
3. Свойства нормальной микрофлоры организма человека, определяющие ее роль как неспецифического фактора иммунитета.
4. Роль интерферона в защите организма человека.
5. Чем объясняется разница в активности фагоцитоза в неиммунном и иммунном организме и с чем это связяно?
6. Какие особенности лимфоцитов определяют их разделение на Т- и В-лимфоциты и их субпопуляции?
7. Что собой представляют клеточные компоненты лимфоцитов СД и какими методами их можно определить?
8. Суть Е- и ЕАС-розеткоообразования для определения количества лимфоцитов.
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 215-261, 322-325.
2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С. 77-100.
3. ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 190-207, 232.
Лекции по микробиологии.
Тесты.